Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология»


НазваниеКурс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология»
страница1/10
Дата публикации15.06.2013
Размер0.99 Mb.
ТипДокументы
userdocs.ru > Биология > Документы
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10


О. В. Блажевич

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

Курс лекций


Минск

БГУ

2005


О. В. Блажевич

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК

Курс лекций
Для студентов специальности G 31 01 01 «Биология»

(направление «Биотехнология» G 31 01 01-03)
Минск

БГУ

2005


УДК 577.95(075.8)

ББК 28.03р.я.73

К 90

Р е ц е н з е н т

кандидат биологических наук, доцент М. А. Титок
Печатается по решению

Редакционно-издательского совета

Белорусского государственного университета

Блажевич О. В.

К 90 Культивирование клеток: Курс лекций / О. В. Блажевич. – Мн.: БГУ, 2005. – 80 с.

ISBN
В данном издании приведены основные методы культивирования клеток микроорганизмов, растений и животных, способы подготовки к эксперименту, принципы составления и основные типы питательных сред, типовые приборы, используемые при культивировании клеток. Предназначено для студентов биологического факультета направления G 31 01 01-03 «Биотехнология».
УДК 577.95(075.8)

ББК 28.03р.я.73

ISBN © Блажевич О. В., 2005

© БГУ, 2003
ВВЕДЕНИЕ

Клеточные культуры с каждым годом находят все большее применение в самых разнообразных областях биологии, медицины и сельского хозяйства. Их используют при решении таких общебиологических проблем, как выяснение механизмов дифференцировки и пролиферации, взаимодействия клеток со средой, адаптации, старения, биологической подвижности, злокачественной трансформации и многих других.

Важную роль клеточные культуры играют в биотехнологии при производстве вакцин и биологически активных веществ. Они являются исходным материалом для создания клеток-продуцентов, используются в целях повышения продуктивности сельскохозяйственных животных и для выведения новых сортов растений. Культуры клеток применяются для диагностики и лечения наследственных заболеваний, в качестве тест-объектов при испытании новых фармакологических веществ, а также для сохранения генофонда исчезающих видов животных и растений.

Широкое распространение клеточных культур и постоянно возникающие новые аспекты их применения обусловлены бурным прогрессом техники культивирования и появлением все нового числа клеточных линий.

В отличие от микроорганизмов, которые издавна используются в традиционных технологиях (хлебопечение, производство кисломолочных продуктов и т.д.), культуры клеток высших организмов являются сравнительно молодым направлением биотехнологии. С использованием данных биообъектов может быть налажено производство биологически активных веществ, вакцин, моноклональных антител и многое другое.


  1. Оборудование, используемое при работе с клеточными культурами

Оборудование для очистки воды

Качество воды, используемой для приготовления питательных сред либо для мытья культуральной посуды, имеет важное значение. До недавнего времени такая вода приготавливалась путем простой и двукратной дистилляции питьевой воды. В настоящее время наряду с традиционными широкое применение получили методы очистки воды путем использования физико-химических процессов обратного осмоса, ионного обмена и мембранной фильтрации. Водопроводная вода, используемая в качестве исходной и прошедшая в этих установках через очистку обратным осмосом, поступает на фильтры из активированного угля, с них – на колонки с ионообменными смолами и затем на мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. При необходимости вода дополнительно подвергается воздействию мощного потока УФ облучения.

Для очистки воды подобным способом наиболее часто применяются установки типа ОВ-1, состоящие из двух конструктивно самостоятельных частей, допускающих независимое использование – ОВ-2 и ОВ-3. Установка ОВ-2 осуществляет приготовление общелабораторной воды, превосходящей по качеству очистки дистиллированную воду. Установка ОВ-3 предназначена для получения пригодной для приготовления питательных сред сверхчистой из общелабораторной или дистиллированной воды.

^
Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды

Приборы и аппараты для мытья и стерилизации посуды обеспечивают выполнение всех этапов технологического процесса: предварительную стерилизацию посуды, поступающей из опыта, насыщенным водяным паром в паровых стерилизаторах (автоклавах); предварительное замачивание в водных растворах химических реагентов (5 % растворе гипохлорита натрия, 3 % растворе перекиси водорода и т. д.); полоскание после замачивания холодной или слегка нагретой водой; мытье горячим раствором детергента с низким пенообразованием; вторичное полоскание горячей водой; финишное полоскание дистиллированной или общелабораторной водой; сушку в сушильных шкафах с принудительной продувкой горячим воздухом; упаковку и финишную стерилизацию в паровых или воздушных стерилизаторах.

Оптимальным вариантом для мытья посуды является использование автоматических моечных машин («Forma Scientific», «Miele», «Hotpack-Heinicke» либо отечественных машин типа P3-AMM).


^
Приборы для дозирования, разведения и пробоотбора

В практике работ с клеточными культурами постоянно возникает необходимость массового дозирования, пробоотбора или разведения биологически активных жидкостей. Для этого используются автоматические или полуавтоматические устройства, называемые в различных источниках дозаторы-дилюторы, автоматические пипетки и т. п.

Одним из основных требований к такого рода приборам является отсутствие контакта между дозируемым раствором и частями конструкции дозатора. Данным требованиям отвечают полуавтоматические шприцевые дозаторы и автоматические шприцевые дозаторы, которые производят разведение или дозирование одновременно по двум каналам и могут работать как в автоматическом, так и полуавтоматическом режимах.

Наиболее часто применяемый автоматический шприцевой дозатор типа «Дозатрон-4» предназначен для автоматического дозирования жидкостей в иммунологические планшеты с микрокюветами. Объем единичной дозы устанавливается в зависимости от целей эксперимента.

Пипетки лабораторные типа ПЛ-01, дозаторы пипеточные типа КДП-1 и П1 производят полуавтоматическое дозирование биологически активных жидкостей. Пипетки лабораторные ПЛ-01 поставляются в наборах из 3 моделей. Величина дозы задается пользователем в определенном диапазоне (2-20мкл, 20-200 мкл, 200-1000 мкл). Комплект дозаторов пипеточных КДП-1 включает 8 моделей, каждая из которых обеспечивает выдачу 2 фиксированных по объему доз (от 5 до 1000 мкл). Комплект дозаторов П1 включает 5 моделей, настроенных на 1 фиксированную дозу (от 20 до 500 мкл). Все указанные типы устройств предполагают использование сменных наконечников, которые могут подвергаться паровой стерилизации и повторно использоваться.

Описанные выше приборы позволяют работу с жидкостями, нагретыми до 40 градусов и имеющими вязкость, близкую к вязкости воды. Тем самым не обеспечивается дозирование питательных сред на основе агара, которые для придания им малой вязкости должны быть нагреты до температуры не менее 60о С. В таких случаях используются приборы типа «Агар-1». Этот аппарат для разлива питательных сред, состоящий из перистальтического насоса-дозатора и разливочного механизма, обеспечивает автоматическое одновременное заполнение в течение 1 минуты 16 стеклянных чашек Петри диаметром 100 мм, находящихся в специальных планшетах. Стерильные условия в аппарате поддерживаются путем УФ облучения его внутреннего объема.

В экспериментах также применяются устройства малой лабораторной техники, не являющиеся по своей сути дозаторами, но способные облегчить этот процесс. Это так называемые приборы «Pipet-Aid» (фирмы «Flow», «Bellco», «Cole-Parmer» и другие), предназначенные для пробоотбора и выдачи дозы при работе с пипетками Пастера и любыми градуированными пипетками емкостью до 75 мл. Пипетка вставляется в специальный держатель, соединенный с малогабаритным вакуумным насосом, находящимся либо непосредственно в держателе, либо автономно. Управление работой прибора производится нажатием кнопок, размещенных на держателе.


^
Устройства для приготовления питательных сред

Одним из главных требований к жидким питательным средам для клеточных культур является их стерильность, достигаемая в ряде случаев и так называемой стерилизующей фильтрацией, освобождающей питательные среды от примесных частиц, бактерий и коллоидов.

Следует различать микро- и ультрафильтрацию сред. При микрофильтрации из жидкости удаляются частицы примесей и бактерий размерами от 0,25 до 10 мкм. Ультрафильтрация приводит к извлечению из раствора очень мелких частиц и коллоидов, а также молекул растворенных веществ с молекулярными массами от 1 тысячи до 1 миллиона.

Процесс микрофильтрации осуществляется пропусканием жидкости через мембранные или глубинные фильтры. Ряд недостатков, свойственных глубинным фильтрам, изготавливаемым из ваты, стекловолокна, асбеста, фарфора и других материалов (например, возможность роста микроорганизмов в массе фильтра, поглощение значительных количеств фильтруемых жидкостей), делают предпочтительным использование при очистке питательных сред мембранных фильтров, которые имеют поры гарантированного размера и лишены перечисленных выше недостатков. Мембранные фильтры изготавливаются из различных полимеров, в том числе позволяющих стерилизацию (фторопласт, поливинилдендифторид, эфиры целлюлозы) и обеспечивающих химическую стойкость к компонентам питательных сред. Для стерилизующей фильтрации питательных сред чаще всего используются мембранные фильтры с диаметром 0,2-0,22 мкм. Для очистки питательных сред пригодны мембранные фильтры, производимые фирмами «Millipore», «Sartorius», «Shleiher-Shull» и другие.

В общем случае установка для стерилизующей фильтрации состоит из системы создания избыточного давления на фильтруемую жидкость, стерильного держателя фильтра, фильтрующей мембраны, трубопроводов и сосудов для размещения фильтруемой жидкости и фильтрата.

Для обеспечения движения жидкости через фильтр к ней необходимо приложить определенное давление извне. Подобное давление может быть создано центробежными силами, вакуумом на выходе установки, но чаще для этой цели используется подача нейтрального газа (например, азота) под определенным давлением в сосуд со средой, подлежащей очистке. Величина избыточного давления зависит от размера пор и площади мембраны.

^
Помещения для работы с культурами клеток

Стерилизация питательных сред, как и все другие манипуляции при работе с клеточными культурами, проводится в боксовых помещениях или в ламинар-боксах.

Боксовое помещение представляет собой изолированную комнату с несорбирующими пыль моющимися покрытиями, имеющую предбоксник и обеспеченную необходимым общим и специальным освещением, системами приточной и вытяжной вентиляции, холодным и горячим водоснабжением, а также подводами газов и сжатого воздуха.

Альтернативой боксовым помещениям, требующей меньших затрат на оборудование, являются ламинар-боксы или стерильные рабочие места. В этом случае в любом помещении может быть создан локальный стерильный объем, необходимый для работы и создающий биологическую защиту пользователей. Технически задача решается путем постоянного обдува места проведения работ ламинарным потоком. При работе с заведомо непатогенными материалами поток обеспыленного воздуха из рабочей зоны выходит непосредственно в окружающее пространство. В случае работы с потенциально патогенным материалом воздух перед выходом из рабочей зоны дополнительно фильтруется, возможность обдува оператора при этом исключена. В зависимости от устройства ламинар-бокса поток обеспыленного воздуха в рабочей зоне может быть горизонтальным, вертикальным или наклонным.

Ламинар-бокс с горизонтальным потоком обеспыленного воздуха типа УОБГ (установка обеспылевания биологическая с горизонтальным потоком) обеспечивает очистку воздуха, подаваемого в рабочую зону, путем фильтрации на фильтрах грубой и тонкой очистки, встроенных в прибор (по мере загрязнения грубый фильтр промывается, тонкий сменяется). Прибор имеет встроенные источники освещения, УФ облучения (для стерилизации рабочей зоны в перерывах между использованием бокса) и регулятор скорости воздушного потока.

Организация ламинар-боксов с вертикальным и наклонным потоком обеспыленного воздуха типов УОБВ и УОБН аналогична организации ламинар-бокса с горизонтальным потоком, описанной выше.

Ламинар-бокс для работ с потенциально патогенными культурами типа БП-4004 («Бокс-Р») имеет некоторые отличия. В приборе обеспечивается рециркуляция воздушного потока, заключающаяся в том, что воздух из рабочего объема попадает на специальный фильтр тонкой очистки, откуда часть его выходит в окружающее пространство, а остальной поток повторно проходит через фильтр тонкой очистки и вновь поступает в рабочий объем. Этим достигается невозможность выноса обрабатываемого материала в помещение. Возможность попадания выходящего воздуха на оператора предотвращается созданием зоны подсоса на открытой стороне рабочего объема бокса. Прибор имеет встроенные источники света и УФ облучения, столешницу из нержавеющей стали. Передняя часть рабочего объема закрыта прозрачным стеклом, перемещаемым по высоте. Бокс снабжен системой регулирования скорости потока воздуха и индикаторами загрязнения фильтра тонкой очистки.

Перечисленные выше типы ламинар-боксов предназначены для размещения в любых производственных помещениях, имеющих приточную вентиляцию с грубой предварительной очисткой воздуха.

^
Оборудование культуральных лабораторий
Лабораторные термостаты

Лабораторные термостаты для культивирования клеток должны отвечать ряду специальных требований: 1) обеспечивать высокую стабильность поддержания заданной температуры, 2) создавать минимальный градиент температуры по полезному объему, 3) обладать системой быстрого восстановления температуры после кратковременного открывания полезного объема, 4) внутренний объем должен изготавливаться из биологически пассивных материалов, т. е. не влияющих на жизнедеятельность клеток и стойких к воздействию компонентов питательных сред. Материалы и покрытия внутренних и наружных частей конструкции термостата должны позволять деконтаминацию водными растворами спирта ректификата и стерилизацию УФ облучением.

По своей конструкции лабораторные термостаты подразделяются на жидкостные и воздушные. В жидкостных термостатах полезный объем окружен емкостью, наполненной дистиллированной водой, которую собственно и нагревают. Воздушные термостаты имеют полезный объем, непосредственно контактирующий с электронагревательными элементами. Жидкостные термостаты обеспечивают малые значения температурного градиента в камере, но имеют очень большую тепловую инерцию и поэтому длительное время вхождения в рабочий режим. Усовершенствованные формы воздушных термостатов, ранее уступавших жидкостным по ряду основных параметров, теперь составляют значительную часть серийно выпускаемых моделей.
^ СО2 - инкубаторы

Необходимость поддержания постоянной величины рН в питательной среде и ее минимального испарения в период инкубации клеток привела к разработке специальных приборов, аналогичных описанным выше термостатам. Главным отличием является наличие систем создания и поддержания определенного состава газовой среды в полезном объеме и высокой относительной влажности в нем. Это так называемые углекислотные инкубаторы, выпускаемые фирмами «Heraues», «Hotpack», «Flow».

Газовая среда в камерах СО2 - инкубатора содержит повышенную концентрацию кислорода и углекислого газа, а в большинстве случаев только углекислого газа. Величина концентрации задается по условиям культивирования и поддерживается автоматически. В автоматических СО2 - инкубаторах заданный состав газовой среды поддерживается дозированным поступлением нужного газа в поток очищенного от пыли внешнего воздуха, подаваемого во внутренний объем прибора. Другой разновидностью инкубаторов являются так называемые газо-проточные инкубаторы типа ГПИ-1, где подача нужных газов производится непрерывно, а точное процентное содержание достигается изменением скорости протока.
Аэраторы

Для обеспечения аэрации культуральной среды – снабжения кислородом - используют воздух, воздух, обогащенный кислородом, реже чистый кислород. Процессы, протекающие без доступа кислорода (анаэробные), зависят от газообразных субстратов и требуют отвода газообразных продуктов жизнедеятельности. Аэраторы – основной пример функционирующих систем газоснабжения и газоотвода.
^ Лабораторные встряхиватели

Большое значение в оснащении лаборатории, предназначенной для культивирования клеток, имеют приборы, обеспечивающие принудительное перемешивание питательных сред с помещенными в них клеточными культурами, обеспечивая лучший газообмен, и, тем самым, повышая эффективность культивирования. Большинство моделей встряхивателей позволяет перемешивание в одном режиме – вращательном или возвратно-поступательном. Хотя наиболее современные модели (фирма «Infors») являются универсальными, т. е. работают в разных режимах перемешивания. Роллерные установки – аппараты, позволяющие успешно применять один из общепринятых методов культивирования клеток – выращивание их в цилиндрических сосудах из боросиликатного стекла с небольшим количеством питательной среды, вращающихся в горизонтальном положении со скоростью 8 оборотов/мин, обеспечивая постоянное перемешивание питательной среды и интенсивный рост клеток. Для повышения эффективности массового культивирования установки обеспечены системой, дающей возможность заменять питательную среду и удалять супернатант без остановки вращения. Для этого сосуды снабжаются специальными перфузионными пробками, в которых центральная часть вращается независимо от периферийной. В эту часть пробки вводятся трубки для смены питательной среды, удаления супернатанта и введения инокулята. В состав данной системы также входят перистальтические насосы и блок автоматики, регулирующий их работу.
^ Лабораторные ферментеры

Это комплексы приборов и аппаратов для массового суспензионного или глубинного культивирования клеточных и бактериальных культур. В лабораторной практике ферментеры применяются для ведения научно-исследовательских работ или отработки технологии массового культивирования (пилотные биореакторы).

В общем случае ферментер состоит из культивационного сосуда, насосов и соединительных трубопроводов (для подачи питательной среды, газов, инокулята и отбора продукта), измерительных приборов и регуляторов, управляющих температурой среды в сосуде, ее рН, окислительно-восстановительным потенциалом и другими параметрами.

В лабораторной практике наиболее часто применяются ферментеры с емкостью сосудов от 1 до 20 л, для отработки технологий – от 30 до 400 л. Во всех случаях питательной средой заполняется не более 75 % объема сосуда.

Части ферментеров, контактирующие с питательной средой (сосуды, соединительные трубопроводы, насосы и др.), изготавливаются из биологически пассивных, химически стойких материалов, позволяющих производить стерилизацию насыщенным водяным паром (качественная нержавеющая сталь, фторопласт, боросиликатное стекло, силиконовая резина).

Сосуды ферментеров имеют цилиндрическую (реже коническую) форму. В них размещены датчики температуры, рН, кислорода, а также система для аэрации питательной среды, производимой барботированием газов (подача газов снизу через барботер) через питательную среду или сочетанием продувки газов с механическим перемешиванием среды. При использовании механических мешалок их соединение с приводным двигателем производится при помощи магнитных муфт, что снижает риск загрязнения питательной среды. Помимо механического и пневматического перемешивания используются также системы циркуляционного (гидродинамического) перемешивания направленным током жидкости по замкнутому контуру при помощи насосов.

Большинство перемешиваемых и аэрируемых культур во время роста образуют довольно много пены. Образование на поверхности среды культивирования слоя из пузырьков связано с наличием в среде поверхностно-активных веществ (ПАВ), к числу которых относятся продукты распада жиров – мыла, а также белки. ПАВ включают как полярные ионные, так и неполярные группировки. Заряженные группы имеют сродство к водной фазе, а нейтральные выталкиваются в воздушную фазу, где, встраиваясь в стенки газовых пузырьков, увеличивают время их жизни. Умеренное пенообразование способствует росту многих аэробных микроорганизмов (пенный слой – кислородный коктейль). Особое внимание уделяется борьбе с избыточным пенообразованием, так как, если не препятствовать этому, пена смачивает фильтры для стерилизации воздуха, что приводит к контаминации культуры посторонней микрофлорой, уменьшению полезного объема биореактора, а также выходу пены наружу. Контроль пенообразования осуществляется путем введения в сосуд специального датчика. Для борьбы с избыточным пенообразованием используется механическое и химическое пеногашение. При механическом пеногашении лопасти пеногасителя размещаются на валу мешалки. При химическом пеногашении в крышке сосуда предусматривается специальный ввод для реагента гашения. Химические пеногасители более дешевы, их используют время от времени при необходимости подавления пенообразования. Однако при добавлении этих веществ может изменяться состав питательной среды. Пеногасящие вещества растительного (кукурузное, касторовое, соевое, подсолнечное масло, масло из семян хлопчатника и другие) и животного (свиной, говяжий, бараний, китовый и другие жиры) происхождения могут служить микроорганизмам источником углерода и энергии и, следовательно, стимулировать их активное развитие. Однако известны случаи, когда природные пеногасители оказывали отрицательное действие на метаболизм клетки. А такие неметаболизируемые пеногасители, как силиконы, в высокой концентрации токсичны. Поэтому пеногасители, являющиеся поверхностно-активными веществами, следует использовать только в очень низких концентрациях и только после тщательной проверки. Пеногасители добавляют непосредственно в среду перед стерилизацией или в ферментер через специальный ввод.
2. Культуральная посуда

Основная часть ассортимента специальной культуральной посуды предназначена для роста клеток в монослое, что определяет особые требования к свойствам поверхности и материала изделий, как из стекла, так и из пластика. Для культивирования клеток обычно используют флаконы, колбы, матрасы, чашки Петри, платы, роллерные сосуды, пробирки, пипетки и т. д.
^ Посуда из стекла

Хотя в последние годы широко применяется пластиковая посуда одноразового использования, посуда из стекла не утратила своего значения, благодаря ряду бесспорных преимуществ: хорошие адгезионные свойства поверхности, способствующие прикреплению клеток; многократность использования; биологическая инертность стекла ряда составов; термостойкость и другие. Кроме того, в экспериментах с контролируемым уровнем кислорода необходимо пользоваться именно стеклянной посудой, т. к. в пластике кислород может растворяться. Помимо этого из пластика могут экстрагироваться водо-растворимые органические соединения.

Для стеклянной лабораторной и культуральной посуды на практике в основном применяются два типа составов – многощелочное и малощелочное боросиликатное стекло типа «Пирекс». Щелочесодержащие силикатные стекла имеют недостаточную термостойкость и химическую устойчивость к воде, кислотам и щелочам. Алюмоборосиликатные малощелочные стекла типа «Пирекс» характеризуются высокой устойчивостью к воде, устойчивостью к щелочным растворам и ко всем кислотам за исключением плавиковой (фтористоводородной) и горячей фосфорной. Кроме того стекла типа «Пирекс» обладают хорошими оптическими свойствами.

Существует также группа макропористых стекол, которые не используются для изготовления посуды, но применяются при культивировании клеток в качестве микроносителей.

Однако успех в эксперименте обеспечивается не только качеством стекла, но и степенью подготовки лабораторной посуды. Посуда для культивирования должна быть чистой физически, химически и бактериологически.
^ Пластиковая посуда

Начиная с 1965 года, все большее применение в лабораторной практике находит пластиковая посуда одноразового использования. При работе с культурами клеток пластиковая посуда в отдельных случаях более пригодна из-за характерных особенностей некоторых клеточных линий. Такая посуда проста в использовании, т. к. выпускается в стерильном, готовом к работе виде. Стерилизация производится в процессе изготовления физическими (облучение УФ светом или гамма лучами) или химическими (газы – окись этилена, жидкости – этиловый спирт, раствор пергидроля) способами. Пластиковая посуда производится в двух модификациях – для культивирования микроорганизмов и для культивирования клеток. Такое разделение вызвано тем, что культивируемые клетки (речь идет о монослойном культивировании) в отличие от бактериальных клеток находятся в непосредственном контакте с поверхностью сосуда, которая является для них субстратом. Клетки оседают на этой поверхности, прикрепляются и распластываются. Для улучшения адгезионных свойств поверхности из полистирола ее подвергают специальной обработке, в то время как биологическая посуда не обрабатывается.

Таким образом, одним из первых условий успешного культивирования клеток является хороший субстрат, т.е. посуда, обеспечивающая максимальную адгезию, распластывание и, следовательно, рост.


  1. Субстраты для культивирования биообъектов
^
Принципы составления питательных сред

Все живые клетки нуждаются в экзогенных источниках питания, содержащихся в питательных средах. Питательная среда обеспечивает жизнедеятельность, рост и развитие биообъектов.

Прежде, чем начинать работы по культивированию разных типов клеток, необходимо точно знать их питательные потребности и зависимости.

Постоянным компонентом питательных сред является вода, в которой нуждаются все живые клетки. Питательные вещества образуют в воде истинные (минеральные соли, сахара, аминокислоты, карбоновые кислоты, спирты, альдегиды) или коллоидные (белки, липиды, неорганические соединения) растворы. Некоторые компоненты питательных сред, находящиеся в твердом агрегатном состоянии, могут либо образовывать придонный осадок, либо равномерно распределяться по всему объему в виде взвеси, либо плавать на поверхности раствора (частицы угля). Жидкие углеводороды при внесении в воду образуют несмешивающуюся фракцию.

В питательной среде должны присутствовать все элементы, необходимые для построения компонентов живых клеток в доступной для усвоения форме. В больших количествах клеткам необходимы макроэлементы: углерод, азот, кислород, водород, фосфор, сера, калий, кальций, магний. Снабжение клеток кислородом и водородом осуществляется за счет воды. Углерод является составной частью всех органических соединений и его источники многочисленны и многообразны: чаще всего сахара, многоатомные спирты и органические кислоты. В качестве азотистого субстрата для изготовления питательных сред служат в основном белки животного и растительного происхождения.

Помимо макроэлементов клетки в незначительных количествах нуждаются также и в некоторых микроэлементах: натрий, марганец, никель, кобальт, хлор, цинк, медь, кремний, молибден, бор, ванадий и некоторые другие.

Кроме основных пластических и энергетических компонентов питательные среды могут содержать и так называемые факторы роста. Это органические соединения (витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания и др.), в которых нуждаются ауксотрофные клетки и которые они синтезировать не в состоянии. Отсутствие таких веществ приводит к нарушению обменных процессов и прекращению роста клеток.

В качестве необходимых компонентов питательных сред могут выступать газы: хорошо (NH3, H2S), умеренно (CO2) или плохо (N2, O2, H2, CH4) растворимые в воде.

Питательные среды могут иметь неопределенный состав, т. е. включать биогенные добавки (растительного, животного или микробного происхождения), например, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, кукурузную муку, морские водоросли и т. д. Такие питательные среды называются натуральными. Применяют также среды, приготовленные из чисто химических соединений в заранее определенных соотношениях. Это так называемые синтетические среды. Применение находят и полусинтетические питательные среды, сочетающие в своем составе компоненты как натуральных, так и синтетических сред.

Среды данных типов имеют как преимущества, так и недостатки. С экономической точки зрения наиболее целесообразно использование природного, более дешевого сырья, чем веществ в чистом виде, полученных химическим путем. Однако только применение сред строго определенного состава позволяет точно регистрировать и регулировать протекающие в культуральной среде процессы, добиваясь их оптимизации. Компромиссным подходом является использование полусинтетических сред, в состав которых наряду с соединениями известной химической природы входят биогенные добавки.

Определенные типы и состав питательных сред для культивирования различных видов клеток будут рассмотрены ниже одновременно с особенностями культивирования данных клеток.


  1. Культивирование клеток

4.1. Культивирование клеток микроорганизмов

Исследование культивирования микроорганизмов начинается с 1830 года, когда Ш. Каньяр де Латур, Ф. Кютцинг и Т. Шванн открыли причину брожения вина (наличие клеток дрожжей).

В дальнейшем в области культивирования клеток не было никакого прогресса вплоть до 1850-х годов, когда Л. Пастер начал свои фундаментальные исследования: изучение физиологии дрожжей и бактерий, введение асептических методов, минимальных сред и исследование пищевых потребностей микроорганизмов и роли кислорода в процессах их жизнедеятельности. Работами Пастера и его ученика Ролэна была установлена потребность в главных и второстепенных компонентах среды и в источниках энергии. Первая полная среда определенного состава была получена Ролэном в 1869 г. для культивирования грибов рода Aspergillus. Работа вызывает интерес еще и тем, что Ролэн определил пищевые потребности грибов не только качественно, но и количественно.

Говоря о замечательных работах Пастера и Ролэна, необходимо отметить, что в их распоряжении не было метода чистых культур, предложенного Р. Кохом несколько позже (в 70-е годы) и дающего значительные преимущества выращивания микроорганизмов. Начиная с изящных работ Коха, методы культивирования стали основной заботой микробиологов.

Потребность микроорганизмов в сложных органических веществах - факторах роста - впервые была обнаружена Вильдье в 1901г., когда он открыл витамин В, или «факторы биос», необходимые для роста дрожжей.

В 30-е годы с введением Клювером и Перквином метода колб на качалках началось развитие аппаратуры культивирования. Это дало возможность применять лабораторный метод для аэрации глубинных культур, особенно глубинных культур аэробных грибов, которые раньше выращивались только на поверхности твердых или жидких сред. В поверхностных культурах окружение организма гетерогенно, а в глубинных – гомогенно, что проще для изучения и контроля. Впоследствии глубинные культуры аэробных грибов сыграли значительную роль в развитии промышленного производства антибиотиков. Возрастающее технологическое значение культуры микроорганизмов значительно стимулировало интерес к этой области и привело в 40-50-е годы к созданию ферментеров с автоматической регуляцией условий среды. С этого времени, благодаря активному развитию теории непрерывного культивирования хемостатного типа, открылись широкие горизонты не только теоретического развития, но и практического применения культур клеток.

  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10

Похожие:

Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconУчебное пособие (курс лекций)
Курс лекций по дисциплине «Физика горных пород» разработан для студентов специальности 130201. 65 Геофизические методы поисков и...
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconСтрахование ответственности курс лекций
Содержит курс лекций по дисциплине «Страхование ответственности» и список рекомендуемой литературы для ее изучения. Предназначен...
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКурс лекций для иностранных студентов харьков
К 78 Политология: курс лекций для иностранных студентов. Учебное пособие. – Харьков: хнму, 2012. – 154 с
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКонспект лекций «Ильин А. А. Акушерство и гинекология. Конспект лекций»
Конспект лекций предназначен для подготовки студентов медицинских вузов к сдаче зачетов и экзаменов. Книга включает в себя полный...
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКурс лекций Часть II 2-е издание, стереотипное Минск 2005 удк 321 (476) б бк 66
Белорусского государственного университета культуры, доктор социалогических наук Р. В. Гребенников
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКурс лекций для иностранных студентов ХарЬкОв
Глебова Л. И. История украинской культуры. Курс лекций для иностранных студентов / Л. И. Глебова. – Харьков: хнму, 2012. – 95 с
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconУчебно-методические материалы по дисциплине Основная литература Ачаповская...
Ачаповская М. З. Экономическая теория. Курс лекций для неэкономических специальностей высших учебных заведений/ М. З. Ачаповская....
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКурс лекций по древней философии
Фрагменты публикуются по источнику: Чанышев А. Н. Курс лекций по древней философии: Учеб пособие для филос фак и отделений ун-тов....
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКурс лекций по социологии
Курс лекций по социологии / Р. А. Лаптев; Курский институт социального образования (филиал) ргсу. – Курск, 2011. – с
Курс лекций Минск бгу 2005 О. В. Блажевич культивирование клеток курс лекций Для студентов специальности g 31 01 01 «Биология» направление «Биотехнология» iconКурс лекций Москва Издательство Российского университета дружбы народов 2008
Основы римского права: Курс лекций. Издание 2-е, дополненное и переработанное. М.: Изд-во рудн, 2008. 241 с
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2015
контакты
userdocs.ru
Главная страница