Лекция по биологической химии


НазваниеЛекция по биологической химии
страница9/15
Дата публикации16.03.2013
Размер1.65 Mb.
ТипЛекция
userdocs.ru > Химия > Лекция
1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   15

Пример вычисления активности фермента:

Исходные данные:

Через 10 мин:

25.0 x 10-3 моль л--1 пептида-субстрата,
объем реакционной смеси 2.5 мл,
0.50 µг химотрипсина1

18.6 x 10-3 моль л--1 пептида -субстрата,
Объем реакционной смеси 2.5 мл,
0.50 µг химотрипсина.

Использованный субстрат

= 6.4 x 10-3 моль л-1 за 10 мин

Скорость реакции

= 6.4 x 10-4 моль л-1 мин-1

Активность Фермента
(скорость x объем)

= 6.4 x 10-4 моль л-1 мин-1 x 2.5 x 10-3 л =
= 1.6 x 10-6 моль мин-1

Удельная активность
(активность / масса)

= 1.6 x 10-6 моль мин-1 / 0.50 µг =
= 3.2 x 10-6 моль µг-1 мин-1

Число оборотов
(уд. акт. x молярная масса)

= 3.2 x 10-6 моль µг-1 мин-1 x 25,000 x 106 µг моль-1
= 8.0 x 104 мин-1 =1330 сек-1

Если удельная активность, рассчитанная выше, относится к чистому химотрипсину, образец, давший, например, удельную активность 2.0 x 10-7 моль µг-1 мин-1 - 100 % x 2.0 x 10-7 / 3.2 x 10-6 или 6.3 % чистоты. 1.0 µг такого образца на самом деле содержит лишь 0.063 µг химотрипсина и 0.937 µг примесей.


Рис2-4. Молярное поглощение НАД+,НАДН+Н+, ФАД, ФАДН2 при разных длинах волн поглощаемого света
Методы исследования активности определяются механизмом реакции и природой определяемого вещества. Наиболее широко используются:

  • Измерение изменения спектральных свойств (измерение поглощения света в видимой или ультрафиолетовой области, измерение флюоресценции) при помощи спектрофотометров, ФЭКов, спектрофлуориметров. Эти методы применяют и для определения количества продуктов или субстратов реакции, и для изменений количества коферментов, участвующих в реакции. Последнее нашло широкое применение в практике клинических биохимических лабораторий. В основе этих методов лежит закон Beer-Lambert: A =   x c x l  = log (I0/I) (, поглощение 1 M раствора вещества при специфической длине волны или молярный коэффициент экстинкции; c, концентрация ; A, поглощение ; l, длина в см кюветы спектрофотометра ; I0, интенсивность падающего света; I, интенсивность прошедшего света). В случае, если молярный коэффициент экстинкции ( исследуемого вещества неизвестен, исследователь определяет экспериментально зависимость между поглощением света исследуемого раствора и концентрацией этого вещества и использует полученную закономерность в форме стандартного (калибровочного) графика.

На рисунке 2-4 показаны спектральные характеристики коферментов НАД и ФАД в окисленной и восстановленной форме. Измерение поглощения при 340 нм используется для количественной оценки активности ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции c участием НАД. Вот пример такого расчета для реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой В этой реакции молочная кислота окисляется, передавая водороды на НАД+. При этом НАД+ восстанавливается до НАДН +Н+., который в отличие от НАД+ поглощает свет с длиной волны 340 нм. Допустим, за время проведения реакции поглощение при длине волны 340 нм изменялось на 0.31 единицы в минуту. Измерения проводили в кювете шириной 1 см. Коэффициент молярной экстинкции для НАДН при 340 нм  = 6200 л моль-1 см-1 .



Увеличение [НАДH] =

Увеличение поглощения

e . l

0.31

6200

=5.0 х10-5 моль/л

Эту величину можно использовать для оценки скорости реакции.

  • Измерение изменений концентрации высвобождаемых или поглощаемых во время реакции H+ или ОН- при помощи pH-стата (устройство, которое автоматически добавляет кислоту или основание, сохраняя постоянство pH в реагирующей смеси)

  • Химический анализ с использованием высокоразрешающей жидкостной или газовой хроматографии, или ЯМР или тонкослойной хроматографии. (АТФазы)

  • Изотопный анализ (например, с использованием радиоактивного 32P)




  1. Сопряженные ферментные системы их применение. Номенклатура, классификация ферментов (тривиальная, рациональная, систематическая). Принципы классификации.

С
опряженные реакции – используются в случаях, если нет возможности прямо определить количество продукта исследуемой реакции. В таких случаях в реагирующую смесь добавляется фермент (Е2) катализирующий превращение образующегося продукта в реакции, которую можно оценить количественно, одним из вышеперечисленных методов.

Если фермент Е2 присутствует в избытке, скорость образования C отражает скорость образования В.

Например, сопряженное исследование активности глюкокиназы (используется избыток глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и НАДФ+)

Глюкоза + AТФ → глюкоза 6-Ф + AДФ : (катализируется глюкокиназой –Е1)
Глюкоза-6-Ф + НАДФ+  → 6-фосфоглюконолактон + НАДФН + H+  : ( катализируется глюкоза-6Ф –дегидрогеназой – Е2):

Скорость образования  НАДФH (измеряется по поглощению при 340 нм) пропорциональна активности глюкокиназы (см выше)
В настоящее время известны и используются 3 вида классификации ферментов:

1. Тривиальная (исторически сложившаяся) номенклатура: (пепсин, трипсин).

2. Рациональная предложена французским физиологом П. Дюкло в 1883 году (к корню названия субстрата прибавляется суффикс

- аза (липид - липаза, протеин - протеаза и т.д.).

3. Современная классификация рассмотрена и утверждена V Всемирным биохимическим конгрессом в г. Москве в 1961 г. В основу ее положен тип катализируемой реакции (всего 6 классов):

1) Оксидоредуктазы: катализируют окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Название дается по схеме: донор: « акцептор-оксидоредуктаза» ---> лактат: НАД-оксидоредуктаза.

Различают аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (е) непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы ускоряющие перенос протонов (е) на промежуточный S, но не на кислород; цитохромы - катализируют перенос только е. Сюда также относятся каталаза и пероксидаза.

2) Трансферазы: ферменты, катализирующие перенос (внутри- и межмолекулярный) различных групп атомов. Название дается по форме: «донор - транспортируемая группа - трансфераза ---> метил-, формилтрансферазы, аминотрансферазы.

Оба этих класса ферментов работают при участии коферментов, которые являются водорастворимыми витаминами: В6, В12, В1, В15.

3) Гидролазы: ферменты, катализирующие расщепление внутримолекулярных связей при участии молекулы воды.

Название: «субстрат-гидролаза». К ним относятся все ферменты ЖКТ; в частности: эстеразы - гидролиз сложных эфиров; гликозидазы - гидролиз гликозидных связей углеводов; пептидгидролазы - гидролиз пептидных связей.

4) Гидролазы:

5) Изомеразы: ферменты, катализирующие различные типы реакций изомеризации. Сюда относятся рацемазы и эпимеразы.

6) Лигазы (синтетазы) - ферменты, катализирующие синтез органических веществ из 2-х исходных молекул с использованием энергии АТФ. Название: «X-Y-лигаза». X и Y - исходные вещества. Например: глутомат-аммиак-лигаза.

Кроме всего этого все существующие ферменты (более 2000) имеют свой цифровой шифр, который присваивается по 4-х значному коду. Т. о. шифр каждого фермента состоит из 4-х цифр, разделенных точками и составляется по следующему принципу.

Первая цифра указывает на номер одногоиз классов ферментов.

Вторая цифра озночает подкласс, который характеризует тип связи, на которую действует фермент.

Третья цифра означает подподкласс, который характеризует химическую природу донора или акцептора, участвующего в реакции.

Четвертая цифра обозначает порядковый номер фермента.

Алкогольдегидрогеназа (АДГ); КФ: 1. 1. 1. 1.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ); КФ: 1. 1. 1. 27.
В основе классификации ферментов - тип катализируемой реакции

Большое число ферментов уже в начале XX века поставило перед исследователями вопро­сы о номенклатуре и классификации ферментов. Отличительным признаком фермента в начале XX века стало окончание «аза», которое использовали, добавляя его вначале к на­званию субстрата (amylum -крахмал - амилаза), а затем к названию реакции (дегидрирова­ние - дегидрогеназы). Созданная Международным союзом химиков и биохимиков Ко­миссия по Ферментам (КФ) разработала основные принципы классификации и номенклатуры ферментов, которые были приняты в 1961 г. В основу классификации был положен тип катализируемой ферментом реакции. Все ферменты по этому признаку были разделены на 6 классов, в каждом из которых есть несколько подклассов.

1.Оксидоредуктазы - ферменты, которые катализируют реакции восстановления или окисления. Например алкогольдегидрогеназа, фермент, который окисляет этиловый спирт в уксусный альдегид. Второй фермент, известный как альдегиддегидрогеназа затем преобразовывает уксусный альдегид в ацетил КoA. Оксидоредуктазы часто требуют участия кофакторов, выполняющих роль промежуточных акцепторов водорода в приводимом ниже примере это НАД+.


О
ксидазы –
разновидность оксидоредуктаз. Так называются ферменты, использующие кислород в качестве конечного акцептора водородов. Примером может служить глюкозоксидаза, которая окисляет глюкозу в глюконовую кислоту. Промежуточным акцептором водородов служит ФАД.

Оксидоредуктазы (1.0.0.0.)

1.1.0.0. Действуют на СН-ОН группы доноров

1.1.1.0. НАД+ или НАДФ+ в качестве акцепторов

1.1.1.1. Алкогольдегидрогеназа

1.14.0.0. Действуют на парные доноры при включении в один из них кислорода

1.14.15.0. Один из доноров восстановленный железо-серный белок и

включение одного атома кислорода

1.14.15.1. Цитохром Р-450

1.14.15.5. Кортикостерон 18-монооксигеназа


2.Трансферазы - ферменты, которые переносят функциональные группы от молекулы донора на молекулу акцептор. Примером могут служить метилтрансферазы, которые передает метиловую группу от S -аденозилметионина какому либо акцептору. Ниже показана реакция, катализируемая катехол-O-метилтрансферазой - ферментом, участвующим в метаболизме нейромедиаторов адреналина и норадреналина.



Еще один очень важный пример трансфераз – ферменты катализирующие перенос аминогруппы -трансаминазы.



Трансаминазы используют аминокислоту в качестве донора аминогруппы, которую они переносят на - кетокислоту, превращая соответственно аминокислоту – донор в  кетокислоту и кетокислоту – акцептор в аминокислоту. Это используется для взаимопревращения некоторых аминокислот и позволяет аминокислотам вступать в пути метаболизма углеводов или липидов.

Трансферазами, которые будут часто упоминаться в биохимии, являются киназы, катализирующие перенос фосфата от макроэргической молекулы АТФ на субстрат. Существует множество киназ, играющих важную роль в метаболизме клеток.

Трансферазы (2.0.0.0.)

2.1.0.0.Переносят одноуглеродные группы

2.1.1.0. Метилтрансферазы

2.1.1.1. Никотинамид метилтрансфераза

2.1.1.45. Тимидилат синтаза

2.3.0.0. Ацилтрансферазы

2.3.1.6. холинацетил трансфераза

3. Гидролазы -ферменты катализирующие биологические реакции гидролиза. Они разрывают ковалентные связи. присоединяя по месту разрыва элементы воды. Липазы, фосфатазы, ацетилхолинэстераза и протеазы - все это примеры гидролитических ферментов.

Гидролазы (3.0.0.0.)

3.1.0.0.Действуют на эфирные связи

3.1.1.0.Гидролазы эфиров карбоновых кислот

3.1.1.17. Ацетилхолинэстераза

3.2.1.0. Гликозидгидролазы

3.2.1.1. амилаза

3.2.1.2. -амилаза

3.4.0.0. Действуют на пептидные связи

3.4.21.0.Сериновые протеазы

3.4.21.1.Химотрипсин

3.4.21.4. Трипсин

3.4.21.5. Тромбин



^ 4. Лиазы (десмолазы) –ферменты, которые катализируют распад C-C, C-O и C-N связями негидролитическим путем с образованием двойных связей. Примером может быть фермент ДОФА декарбоксилаза, которая является ключевым ферментом в синтезе биогенных аминов адреналина и норадреналина.


Лиазы(4.0.0.0)

4.1.0.0.Углерод-углерод лиазы

4.1.1.0.Карбокси лиазы

4.1.1.1. Пируватдекарбоксилаза

4.2.0.0. Углерод-кислород-лиазы

4.2.1.0. Гидролиазы

4.2.1.11. Енолаза

4.2.1.12. Фосфоглюконатдегидраза


5. Изомеразы - ферменты, которые катализируют внутримолекулярные перегруппировки. При этом происходит взаимопревращение оптических геометрических и позиционных изомеров. Эпимеразы и рацемазы - примеры ферментов этого класса.

Изомеразы (5.0.0.0.)

5.1.0.0. Рацемазы и эпимеразы

5.1.1.0. Действуют на аминокислоты и их производные

5.1.1.1. Аланинрацемаза

5.3.0.0. Внутримолекулярные оксидоредуктазы.

5.3.1.0.Взаимопревращают альдозы и кетозы

5.3.1.9. Фосфоглюкоизомераза

5.3.1.20. Рибозоизомераза

1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   15

Похожие:

Лекция по биологической химии icon«Биологическая химия»
Предмет биологической химии, ее значение для биологии, медицины, ветеринарии, сельскохозяйственного производства, ветеринарной биотехнологии...
Лекция по биологической химии iconЛекция по биологической химии
Понятия «ферменты»: особенностях ферментативного катализа. О строении и структуре ферментов
Лекция по биологической химии iconБиохимия лабораторный практикум
Разработана: докт мед наук, профессор Т. П. Бондарь кафедры Физико-химические основы медицины, лабораторной диагностики и фармакологии;...
Лекция по биологической химии iconУчебно-методическое пособие к практическим занятиям по биологической химии
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного и медико-профиоактического факультетов медицинских вузов, выполняющих...
Лекция по биологической химии iconМетодические указания для самостоятельной подготовки студентов медицинских...
Методические указания для самостоятельной подготовки сту-дентов медицинских факультетов к практическим занятиям по биологической...
Лекция по биологической химии iconМетодические указания для самостоятельной подготовки студентов медицинских...
Методические указания для самостоятельной подготовки сту-дентов медицинских факультетов к практическим занятиям по биологической...
Лекция по биологической химии iconЗанятие 1 Аминокислоты и белки
Предмет и задачи биологической и клинической химии. Понятие о биохимических реакциях
Лекция по биологической химии iconВопросы к экзамену по Биологической химии для студентов 2 курса медицинского...
Предмет, задачи, методы и место биохимии среди других медицинских и биологических дисциплин
Лекция по биологической химии iconМетодические указания по биоорганической химии для студентов к занятию...
Проекционные формулы Фишера. Относительная и абсолютная конфигурация. D и L система стереохимической номенклатуры
Лекция по биологической химии iconТезисы доклада
Уважаемые коллеги! Приглашаем Вас принять участие в работе VIII международной научно-технической конференции «Актуальные вопросы...
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2015
контакты
userdocs.ru
Главная страница