Биохимия лабораторный практикум


НазваниеБиохимия лабораторный практикум
страница1/17
Дата публикации01.08.2013
Размер2.73 Mb.
ТипПояснительная записка
userdocs.ru > Химия > Пояснительная записка
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   17
Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Ставропольский государственный университет»

БИОХИМИЯ
ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Часть 1

для студентов, обучающихся по специальности «Медицинская биохимия» (060112)
Всего лабораторных часов – 296 ч.

Изучается в 6, 7, 8, 9, 10 семестрах
Разработана: докт. мед. наук, профессор Т.П. Бондарь кафедры Физико-химические основы медицины, лабораторной диагностики и фармакологии; канд. биол. наук, доцент С.Ф. Андрусенко кафедры Биологической и медицинской химии; С.С. Аванесян, преподаватель кафедры Биологической и медицинской химии.
Дата разработки 5.09.2009г.

Согласована:

Декан медико-биолого-химического факультета

_________________/А.Л. Иванов/

«_____»________2009г.
Зав кафедрами

________________/Е.И. Еременко/

________________/ Т.П. Бондарь
Рассмотрено УМК МБХФ

«____» __________2009г.

Протокол №___


Председатель УМК____________

СТАВРОПОЛЬ 2009


БИОХИМИЯ
^ ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ
Лабораторный практикум предназначен для подготовки студентов специальности 060112 – «Медицинская биохимия» и может быть использован при подготовке врачей-интернов и клинических ординаторов специальности «Клиническая лабораторная диагностика» - 158 с.


Составители:

доктор мед. наук, профессор Т.П. Бондарь

канд. биол. наук, доцент С.Ф. Андрусенко

преподаватель С.С. Аванесян
Рецензент:

заведующий кафедры клинической лабораторной диагностики Ставропольского государственной медицинской академии профессор Первушин Ю.В.


^ ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА

При создании лабораторного практикума использована современная концепция преподавания биохимии, основанная на представлении учебного материала в виде завершенных по содержанию разделов. На основе знаний биохимии свое развитие получили новые дисциплины: энзимология, иммунология, молекулярная биология, генная инженерия, биотехнология. Знание биологической химии поможет студенту при изучении других дисциплин (гистологии, физиологии, фармакологии, клинической диагностики и др.).

Изучение курса биологической химии ставит своей задачей дать студентам сведения о химической природе, превращении веществ, входящих в состав организма человека, животных и растений. Обязательным является выполнение всех работ студентами, начиная от приготовления некоторых реактивов, до анализа и оценки результатов исследований. Каждая работа является контрольной задачей и обсуждение полученных результатов легче связать с соответствующим теоретическим материалом, чему способствуют, всесторонне охватывающие изучаемую тему. Методы исследования, изложенные в пособии, могут стать основой для последующей научно-исследовательской работы, подготовки курсовых и дипломных проектов.

Каждая работа построена по единой схеме: тема занятия; цель занятия – достижение единства теоретических знаний, приобретаемых по определенному разделу биохимии, и практических навыков, получаемых студентами при выполнении качественных и количественных исследований; теоретические основы занятия – краткое изложение некоторых вопросов по данной теме, включая знания необходимые для выполнения лабораторной работы и интерпретации ее результатов; ход работы – формирование у студентов умения выполнять лабораторные исследования с использованием биохимических навыков; литература – к каждому занятию дается основная и дополнительная литература для наиболее удобной работы студентов по изучаемой теме.

^ В результате изучения цикла студент должен:

Знать:

  • методические основы организации контроля качества проведения биохимических исследований.

  • правила техники безопасности при работе с медицинским инструментарием и Оборудование и посудам, охраны труда и окружающей среды;

  • теоретические и методические основы медицинской биохимии, необходимые для самостоятельной работы в области исследования природы и механизмов развития патологических процессов, а также для совместной работы с врачами-клиницистами по постановке диагноза, для совершенствования существующих и разработки новых методов диагностики и лечения, для внедрения нового оборудования и разработки современных медицинских технологий.

Уметь:

  • владеть методами исследования и анализа живых систем;

  • интерпретировать экспериментальные результаты с целью выяснения молекулярных механизмов биохимических процессов;

  • опыт наблюдения, описания, идентификации, классификации биологических объектов;

  • организовать рабочее место для проведения биохимических исследований;

  • производить необходимые расчеты;

  • работать на приборах, которыми оснащена лаборатория;

  • соблюдать правила охраны труда и техники безопасности;

  • формулировать задачу исследования, выбирать адекватные методы и аппаратуру для ее решения, адекватные методы интерпретации результатов исследования с привлечением компьютерной техники.

Владеть:

  • основами методов клинической биохимии, иммуноферментными методами;

  • методами математического анализа, методами статистической обработки результатов наблюдений, методами планирования эксперимента;

  • основами лабораторной техники химического эксперимента, методами физико-химического анализа;

  • биохимическими и коагулологическими исследованиями;

  • методами контроля качества биохимических анализов;

  • способами организации преаналитического, аналитического и постаналитического этапа биохимического исследования;

^ Иметь опыт (навык):

- работы с учебниками, специальной медицинской литературой для совершенствования знаний в области биохимии;

- собственноручного выполнения биохимических и гемостазиологических лабораторных тестов.

^ По общим вопросам диагностической работы:

  1. поставить лабораторный диагноз и провести дифференциальный диагноз, используя клинические и дополнительные методы исследования;

  1. провести анализ работы лаборатории, определить способы ее улучшения;

  1. организовать рабочее место для проведения биохимических и других исследований;

  1. провести лабораторное обследование больных с помощью экспресс-методов (при отравлениях, массовых поражениях, катастрофах, авариях);

  1. работать с контрольным материалом;

  2. оценить результат исследования и сформулировать заключение (поставить лабораторный диагноз);

  1. определить необходимость дополнительного обследования больного.

По биохимическим исследованиям:

  1. получить сыворотку, плазму крови, взвесь эритроцитов для исследования;

  1. приготовить Реактивы и материалы;

  1. обработать химическую посуду;

  1. работать на приборах, которыми оснащена лаборатория (фотоэлектроколориметры, спектрофотометры, центрифуги, провести электрофорез белков и др.);

  1. подобрать соответствующие Реактивы и материалы для методов клинической биохимии, адаптировать Реактивы и материалы для используемой аппаратуры;

  1. производить необходимые расчеты;

  1. интерпретировать лабораторные показатели нарушения гемостаза при заболеваниях печени, желудочно-кишечного тракта и других органов;

  1. определять клинико-диагностическое значение лабораторных показателей.

Пособие является методическим руководством к лабораторным занятиям по биологической химии и предназначено для подготовки студентов по специальностям «Медицинская биохимия», а также может быть использована при подготовке врачей-интернов и клинических ординаторов специальности «Клиническая лабораторная диагностика».

^ ОФОРМЛЕНИЕ ЛАБОРАТОРНОГО ЖУРНАЛА

Студент обязан вести лабораторный журнал, который является документом, отражающим всю его работу. На обложке или первой странице журнала должны быть написаны фамилия студента, его инициалы, номер группы, учебный год и название практикума. Для ведения журнала берут общую тетрадь в клетку, в которой сразу же нумеруют все страницы. Первые 2 страницы оставляют для оглавления, которое составляют по ходу работы. Результаты всех измерений или других операций записывают в журнал, используя левые страницы; правые страницы оставляют для расчетов и записей. Запрещается делать записи на отдельных листках бумаги.

Оформление журнала производят только ручкой, лаконично, аккуратно, непосредственно после проведения опыта. Запись должна содержать:

1. Дату выполнения работы. В журнале обязательно указывают дату выполнения эксперимента.

2. Название темы и название опыта - записывается полное название, без сокращений. Работа должна иметь название – заголовок, а каждый ее этап – подзаголовок, поясняющий выполняемую операцию. Заголовки пишутся прописными буквами. Каждый подзаголовок также снабжается заголовком, первая буква которого прописная, остальные строчные. Пункты и подпункты заголовками не снабжаются. Разделы должны иметь порядковые номера в пределах всей работы, обозначенные цифрой с точкой в конце.

3. Цель занятия – достижение единства теоретических знаний, приобретаемых по определенному разделу биохимии, и практических навыков, получаемых при выполнении качественных и количественных исследований.

4. Теоретические основы занятия – краткое изложение некоторых вопросов по данной теме, включая знания необходимые для выполнения лабораторной работы и интерпретации ее результатов.

5. Ход работы - формирует умения выполнять лабораторные исследования с использованием биохимических навыков. Кратко описывают ход работы и приводят использованные литературные источники.

6. Рисунок или схему используемого прибора - иллюстрации размещаются сразу после ссылки на них в тексте. Желательно иллюстрации размещать так, чтобы их можно было просматривать без поворота работы. Если поворот неизбежен, то иллюстрации надо ориентировать так, чтобы для их рассмотрения надо было повернуть работу по часовой стрелке. Иллюстрации должны нумероваться последовательно в пределах раздела и включать номера раздела и порядковый номер рисунка в разделе. Например: рис. 1.2; рис. 2.5. и т.п. Ссылки на ранее упомянутые иллюстрации дают сокращенным словом "смотри", например, (см. рис. 2.1.). При небольшом количестве рисунков допускается сквозная нумерация. Подписи необходимо размещать горизонтально, без рамок.

7. Уравнения происходящих в опытах реакций. Химические и физико-химические символы в тексте, структурные формулы органических соединений и математические формулы должны быть ясно и четко вписаны от руки.

8. Изменение окраски веществ, выделение газов и характер осадка - желательно оформлять результаты в виде таблицы или графика. Таблицы должны следовать за ссылкой на них. Таблицы нумеруются последовательно в пределах всей работы арабскими цифрами. Перед номером таблицы ставится слово "Таблица". Ниже по середине название таблицы. График строят на миллиметровой бумаге с точным обозначением величин на осях координат, и приводят их единицы измерения; графики снабжают заголовком, проставляют дату эксперимента и вклеивают в журнал.

9. Расчеты, проводимые при выполнении работы. Все физические величины нужно приводить в международной системе СИ. Значение переменных в математических выражениях символов должно быть разъяснено при первом их использовании. Значение каждого символа дают с новой строки в той последовательности, в какой они приведены в формуле. Первая строка расшифровки начинается со слова "где" без двоеточия после него, например:

y = ab,

где: y - выход продукта; a, b - постоянные коэффициенты.

10. Указания по технике безопасности – напоминают о правилах работы с веществами в вытяжном шкафу, правила работы с газовой горелкой, электрическими приборами и некоторыми веществами.

11. Выводы - необходимо делать к каждому опыту и всей работе в целом, в том числе и давать ответы на поставленные в занятии .

12. Литература – к каждому занятию дается основная и дополнительная литература для наиболее удобной работы студентов по изучаемой теме.

^ ЛАБОРАТОРНАЯ ПОСУДА И ОБОРУДОВАНИЕ

ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
В практикуме по основам биохимии применяют следующую лабораторную посуду:

  1. Колбы – круглодонные, плоскодонные, мерные (от 25 мл до 5,0 л),

  2. Химические стаканы – различных объемов (чаще от 50 мл до 2,0 л),

  3. Пробирки – цилиндрические и конические,

  4. Цилиндры – от 10 мл до 2,0 л,

  5. Мензурки – от 50 мл до 1,0 л.

  6. Пипетки – емкостью от 0,1 мл до 100 мл – граду­ированные и пипетки Мора, автоматические, доза­торы.

  7. Бюретки (иногда микробюретки).

  8. Промывалки.

  9. Фарфоровые тигли.

  1. Фарфоровые чашки.

  2. Фарфоровые ступки.

  3. Эксикаторы.

  4. Воронки.

  5. Посуда для взвешивания – часовые стекла, бюксы, тигли.

  6. Стеклянные палочки, лопаточки, наконечники.

Зарисовать в тетради лабораторную посуду и записать назначение каждого из вышеперечисленных предметов.
Мытье лабораторной посуды

  1. Посуду после выполнения лабораторного анализа необходимо промыть в проточной водопроводной воде.

  1. Затем тщательно промыть с помощью ершей.

  1. Замочить на 1–2 часа в хромовой смеси («хромпик»). Можно использовать синтетические моющие средства, не содержащие биодобавок.

  2. Отполоскать от моющего средства с помощью про­точной водопроводной воды: 10 раз при использовании хромовой смеси и 15 раз – при использовании синтетических моющих средств.

  1. Прополоскать в проточной дистиллированной воде 3 раза,

  2. Чистую посуду высушить в сушильном шкафу при температуре 150–180 °С.

Сухую посуду (колбы, стаканы) закрыть фильтроваль­ной бумагой либо поставить в шкаф или на стол вверх дном. Пробирки сложить в чистые коробки или ящики столов, выложенные чистой фильтровальной бумагой. Сверху их также следует прикрыть фильтровальной бумагой от пыли и грязи.
Лабораторное Оборудование

  1. Спектрофотометры СФ–4, СФ–16, СФ–26, СФ–46.

  2. Фотоэлектроколориметры (различных марок).

  3. Центрифуги – различных марок и назначения.

  4. рН-метры.

  5. Иономеры с ионоселективными электродами.

  6. Весы: аналитические, торсионные, технические.

  7. Термостат.

  8. Хроматографические камеры.

  9. Автоматические анализаторы.


Подготовка воды для клинико-биохимических исследований

Воду для биохимического анализа следует использовать свежеперегнанную (1–2 дневную), прокипяченную, охлажденную.

  1. Собирать дистиллированную воду следует в стеклянные бутыли лучше с нижним сливом, которые надо обязательно тщательно мыть 1 раз в 10–15 дней, как указано для всей посуды.

  2. Бутыли с дистиллированной водой следует держать с закрытыми крышками или пробками.

  3. Брать воду из бутыли следует через кран нижнего слива. Если такой кран отсутствует, то из силиконового (резинового) шланга с зажимом можно изготовить сифон. Такую систему следует использовать, чтобы полоскать посуду в проточной дистиллированной воде.

  4. Дистиллированную воду для анализа (для разведения реагентов, для контрольной пробы) следует налить в термостойкую колбу через шланг сифона, прокипятить 3–5 минут и после охлаждения закрыть притертой или ватно–марлевой пробкой. Открытой воду не хранить. Колбу регулярно, не реже 1 раза в неделю, мыть по вышеуказанной схеме.

  5. Отливать воду из колбы в стакан для работы мож­но, но стакан использовать только в течение рабочего дня, затем отправлять его в мойку.

  6. Даже если используется деионизированная вода, кроме того, что она должна быть свежеперегнанной (1–2 дневной), ее обязательно следует кипятить. Это необходимо делать, потому что носители, на которых идет очистка воды в деионизаторах (ионообменные смолы), являются хорошей средой для размножения микроорганизмов. Попадая в деионизированную воду, микрофлора очень быстро изменяет ее состав.


^ Общие правила работы с наборами для клинико-биохимических исследований

При работе с биохимическими наборами для того, чтобы избежать наиболее распространенных ошибок, необ­ходимо придерживаться следующих общих правил:

1. Тщательно изучить инструкцию по применению на­бора и пунктуально ей следовать, выполняя все рекомендации по условиям хранения компонентов набора и ра­створа рабочего реагента (температура, тара, время, осве­щение), а также по условиям проведения анализа (темпе­ратура, последовательность добавления реагентов, время реакции и т.д.).

  1. Не использовать наборы, если герметичность их упаковки нарушена или внешний вид не соответствует пас­портным данным.

  2. Наборы с истекшим сроком годности необходимо проверить на правильность определения по контрольным сывороткам. Если определенное вами содержание компонента соответствует паспортным данным контрольной сыворотки, то набор можно использовать. Без проверки использовать просроченные наборы нельзя.

  3. Посуду для приготовления раствора рабочего реагента и пробирки для проведения анализа промыть либо с помощью хромовой смеси (хромпика), либо с помощью моющих средств, не содержащих биодобавки, тщательно прополоскать водопроводной, а затем дистиллированной водой и просушить в сушильном шкафу. Каждый раз для приготовления раствора рабочего реагента брать чистую посуду, не использовать посуду, пробирки, пипетки и на­конечники для автоматических дозаторов повторно.

  4. Использовать только дистиллированную, свежеперегнанную, прокипяченную, охлажденную воду.

  5. Растворы рабочих реагентов из общей склянки (колбы, флакона) отлить в другую склянку (колбу, флакон) в количестве, необходимом на один рабочий день, и пользо­ваться ими, а не отбирать пипеткой многократно из об­щей склянки.

  6. Использовать автоматические дозаторы для отбора проб сыворотки, калибратора, а также раствора рабочего реагента. Дозаторы необходимо регулярно, не менее одного раза в год, поверять.

  7. Для измерения оптической плотности использовать кюветы с толщиной поглощающего свет слоя жидкости 1 см, если не указано специально, что можно использовать кюветы меньшей толщины. Объем помещаемого в кювету исследуемого раствора должен быть достаточным, чтобы луч света проходил ниже уровня жидкости.

  8. При проведении анализа для инкубации проб следует использовать водяной термостат. Если все-таки прихо­дится использовать воздушный термостат, то необходимо увеличить время прогрева рабочего раствора перед нача­лом реакции с 5 минут до 10–15 минут.

  1. Все растворы рабочих реагентов и других реагентов, готовых к использованию, после отбора реагента сле­дует плотно закрыть и держать закрытыми.

  2. Предельно внимательно и аккуратно следует работать с калибратором. Нельзя определять самим концентрацию калибратора или разбавлять его, чтобы получить более низкую концентрацию. Для отбора калибратора сле­дует использовать только новые наконечники.

  3. При внесении пробы в реакционную смесь, особен­но если ее объем составляет 5–10 мкл, необходимо сле­дить, чтобы проба не осталась на стеклах пробирки или кончике пипетки. Смесь после внесения пробы следует тщательно перемешать, не допуская при этом вспенивания.

  4. В процессе растворения реагентов, содержащих ферменты, нельзя допускать вспенивания, так как это может привести к их инактивации.


^ Калибровка мерной посуды

Номинальная емкость мерной посуды не всегда соот­ветствует ее истинной емкости. Для повышения точности объемного анализа мерную посуду, используемую в лабо­ратории, необходимо калибровать. За единицу объема в метрической системе мер прини­мают «истинный литр», т.е. объем, занимаемый массой воды в 1 кг при температуре ее наибольшей плотности (т.е. при 3,98°С), взвешенной в безвоздушном простран­стве.

В качестве стандартной температуры при калиброва­нии мерной посуды в настоящее время принята темпера­тура +20 °С. «Нормальный литр» равен объему такого количества вещества, которое занимает при +20°С объем истинного литра.

Мерную посуду калибруют или проверяют, определяя вес чистой воды, содержащейся в ней, или вес воды, вы­литой из нее, при определенной температуре; по весу воды рассчитывают емкость посуды.

^ Калибровка мерных колб. Емкость мерной колбы про­веряют путем взвешивания на технических весах воды, вмещаемой колбой. Для предотвращения ошибки, связанной с неравноплечностью технических весов, рекомен­дуется следующий порядок взвешивания.

Чистую сухую мерную колбу помещают на левую чаш­ку весов. На эту же чашку ставят разновес, соответству­ющий весу воды в объеме калибруемой колбы. Затем урав­новешивают весы и заполняют колбу дистиллированной водой, имеющей температуру окружающего воздуха. Сле­дят за тем, чтобы при заполнении колбы капли воды не остались на стенке горла колбы выше метки (капли воды снимают фильтровальной бумагой). Колбу с водой взве­шивают, уравновешивая весы снятием разновеса с левой чашки. Вес воды в колбе равен весу разновесов, снятых с левой чашки весов. (Если вес воды в колбе больше веса снятого разновеса, то для уравновешивания разновесы добавляют на правую чашку весов). Определение повто­ряют еще два-три раза.

^ Калибровка пипеток. Чтобы проверить емкость пипетки, надо взвесить на аналитических весах бюкс с крышкой.

Набрать в пипетку дистиллированную воду до черты (по нижнему мениску), перенести ее во взвешенный бюкс. После опорожнения пипетки выжидают еще 15 с и только после этого отнимают кончик пипетки от стенки сосуда. В кончике пипетки всегда1 остается небольшое ко­личество жидкости. На это не обращают внимания, т.к. пипетка градуируется на вытекание, и та капля, которая остается в пипетке, не входит в ее объем. Поэтому эту каплю из пипетки не следует ни выдувать, ни выжимать.

Бюкс, в который перенесли воду, закрыть крышкой и снова взвесить. Вес воды в объеме пипетки находят по разности двух взвешиваний. Процедуру определения ем­кости пипетки проводят трижды, используя для этого три отдельные сухие емкости, и берут среднее арифмети­ческое из 3-х взвешиваний.

При калибровке микропипеток взвешиваемый объем должен превышать погрешность взвешивания в 100 раз, так при калибровке микропипеток вместимостью 10 мкл необходимо поместить во взвешенный бюкс не менее 5 ее объемов.

^ Калибровка бюреток. Процедура проверки емкости бю­ретки такая же, как для пипеток, только проделывать ее надо для каждого объема последовательно, т.е. если бю­ретка вместимостью 50 мл, то взвешивают три раза 5 мл воды (спуская воду от нулевого деления до 5) и находят поправку, затем 10 мл и т.д. до 50 мл. При использова­нии автоматических микропипеток лучше пользоваться одним дозатором для отбора проб и калибратора, меняя только наконечники.
^ Применение международной системы единиц (СИ) в биохимической лабораторной практике

Масса –величина, характеризующая инерционные и гравитационные свойства тела. Массу тела в состоянии покоя опреде­ляют взвешиванием на весах. Результат взвешивания тела на весах сле­дует называть массой, а не весом и выражать в единицах массы – кило­граммах (кг), граммах (г), дольных от грамма – миллиграммах (мг), микрограммах (мкг), нанограммах (нг).

^ Количество вещества величина, определяемая числом струк­турных элементов (атомов, молекул, ионов, электронов и других ча­стиц) в рассматриваемом веществе. За единицу количества вещества принят моль (моль – это количество вещества, содержащее столько структурных единиц, сколько содержится атомов в 0,012 кг изотопа углерода 12С. Число частиц в моле любого вещества одно и то же. Оно равно 6,021023 и называется «постоянной Авогадро»). Кратные и дольные единицы от моль – киломоль (кмоль), миллимоль (ммоль), микромоль (мкмоль) и др.

^ Молярная масса это масса вещества, взятого в количестве 1 моль. Ее выражают в кг/моль или г/моль. В общем случае молярная масса вещества, выраженная в граммах, численно равна его относительной молекулярной (атом­ной) массе, выраженной в атомных единицах массы.

^ Массовая концентрация компонента – отношение массы компо­нента к объему смеси. Единицы в СИ – кг/м3, в биохимических ис­следованиях – г/л.

Молярная концентрация компонента (молярность компонента) – отношение количества вещества к объему смеси. Единицы в СИ – модь/м3, в биохимических исследованиях – моль/л (для вы­ражения концентрации веществ с известной относительной моляр­ной массой).

^ Нормальная концентрация, или нормальность, выражается чис­лом эквивалентов вещества, содержащегося в 1 л раствора. Раствор, в 1 л которого содержится один эквивалент растворимого вещества, называется нормальным (0,1 экв. вещества – децинормальным, 0,01 экв. – сантинормальным, 0,001 экв. – миллинормальным).

Понятие «активность фермента» применяют для количествен­ной характеристики биологических катализаторов – ферментов. В качестве единицы СИ принимается моль/с (моль в секунду) – ак­тивность фермента, катализирующего превращение 1 моля субстра­та (имеется в виду убыль субстрата или образование продукта реак­ции) в 1 секунду при определенных условиях.

^ Скорость ферментативной реакции определяется по убыли субстрата или образованию продукта реакции за определенное время в определенном объеме исследуемого материала. В качестве единицы СИ принимается моль в секунду на кубический метр – моль/(см3). Однако для выражения результатов биохимических исследований пользуются единицами моль в секунду на литр – моль/(сл) или чаще миллимоль в час на литр – ммоль/(чл).

^ Показатели экскреции исследуемого компонента с суточным объе­мом мочи принято обозначать количеством выводимого вещества, отнесенного к единице измерения «сутки» (например, ммоль/сут, мкмоль/сут, нмоль/сут).

Для правильного использования кратных и дольных значений еди­ниц в табл. представлены соответствующие множители и приставки.

Множители и приставки, применяемые для обозначения кратных и дольных единиц

Множитель

Приставка

Обозначение приставки (русское)

10-18

атто

а

10-15

фемто

ф

10-12

пико

п

10-9

нано

н

10-6

микро

мк

10-3

милли

м

10-2

санти

с

10-1

деци

д

101

дека

да

102

гекто

г

103

кило

к

106

мега

М

109

гига

Г

1012

тера

Т

1015

пета

П

1018

экса

Э


^ Методы расчета экспериментальных данных

Любой экспериментатор при проведении измерений получает серию данных, несколько отличающихся друг от друга, что может быть вызвано многими причинами. В основном различают систематические, случай­ные ошибки и промахи.

Систематические ошибки могут возникнуть в резуль­тате неисправной работы приборов, загрязнения реакти­вов. Такие ошибки повторяются при проведении всей серии измерений. Случайные, не зависимые друг от друга ошибки вызы­ваются непредсказуемыми и поэтому неконтролируемы­ми явлениями. Промахи возникают вследствие недостаточного вни­мания исследователя: несоблюдения условий проведе­ния эксперимента, неправильной подготовки образцов или записи наблюдений, ошибок при выполнении вы­числений.

Статистическую обработку полученных опытным пу­тем данных проводят по следующей схеме. Данные, полученные из п измерений, составляют ряд различающихся между собой величин х1, х2, х3...xn. Из этой серии находят пределы отклонения, где xi – данные, полученные при проведении измерений; – среднее арифметическое, найденное по формуле: .

Сумма всех положительных и отрицательных откло­нений от среднего должна равняться нулю:.Это равенство выполняется тем точнее, чем точнее вычислено значение .

Единичные измерения в серии (выборке) характе­ризуются среднеквадратичной ошибкой или стандарт­ным отклонением :



Число выборок может быть как угодно велико. Каж­дая из них является случайной со своей средней и сред­неквадратичной ошибкой :



Вычисление погрешности результата измерений про­водят при определении степени надежности α – долей случаев, в которых при данном числе измерений сред­нее арифметическое лежит в определенных пределах.

В большинстве случаев принимают α = 0,95 или 0,99. Это значит, что 95% или 99% всех измерений лежат в указанных пределах:

Коэффициент tα,k называется коэффициентом норми­рованных отклонений, или критерием Стьюдента (К). Эту величину находят по специальным таблицам в зави­симости от α и К = n - 1. Величина К называется чис­лом степеней свободы. Коэффициенты нормальных от­клонений для значений а, равные 0,95 и 0,99, приведе­ны в таблице.

Коэффициенты нормальных отклонений (tα,k)

α

К

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0,95

4,30

3,18

2,78

2,57

2,45

2,37

2,31

2,26

2,23

0,99

9,93

5,84

4,60

4,03

3,71

3,50

3,36

3,25

3,17

В завершение расчета определяют относительную ошибку:

Следовательно, порядок вычисления погрешностей должен быть записан в такой последовательности:

1) среднее арифметическое: ;

2) стандартное отклонение: ;

3) среднеквадратичная ошибка среднего: ;

4) погрешность результатов измерений: ,

где tα,k – коэффициент Стьюдента, найденный по таблице;

5) окончательный результат измерений: ;

6) относительная ошибка:
^ ПРИГОТОВЛЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ

В биохимических исследованиях используются расти­тельные и животные ткани, а также продукты жизнедея­тельности животных. В растениях анализу подвергаются семена, корни, корневища, корнеплоды, стебли, листья, цветки. У животных исследуют биохимические показатели в биологических жидкостях (моча, кровь, спинномозго­вая жидкость, молоко), а также в тканях органов (печень, селезенка, желудок, сердце, мозг и т. д.) и мышечную, костную, нервную, жировую ткани, эндокринные железы.

Перед началом анализа исследуемый образец взве­шивают на аналитических весах, а затем ткань измель­чают. Все операции произ­водят при низкой темпера­туре, с охлаждением инст­рументов, используемых во время опытов, а Реактивы и материалы должны быть помещены в ледяную баню. Если разру­шение растительных тка­ней проводили на механи­ческой мельнице, то перед экстракцией по­мол необходимо взвесить, так как часть образца тка­ни во время измельчения может быть потеряна.

Для измельчения животных и растительных тканей с низкой влажностью (5–15%) используются механиче­ские мельницы. Разрушение тканей с высокой влажно­стью (65-–90%) проводят на гомогенизаторах. Ткани со средней влажностью (15–65%) обычно предварительно высушивают в сушильных шкафах с вакуумом при низ­кой температуре (60–70°С), что обеспечивает максималь­ную сохранность в них функционально активных веществ.

Перед началом экстракции ФАВ из разрушенных тка­ней животных и растений необходимо правильно подо­брать растворитель. Экстракцию полярных, заряженных соединений проводят используя полярные растворители (вода, 50%-ный раствор этанола). Экстракцию гидрофоб­ных компонентов гомогената тканей проводят с исполь­зованием неполярных растворителей (гексан, хлороформ, диэтиловый эфир и др.) или водных растворов с детергентами (тритоны: Х-45, Х-100, Х-114, Х-102, Х-165, Х-305; бридж: 35, 56, 58; луброл РХ и WX; твин: 20, 40, 60, 80 и др.).

Реагент

Время экстракции, час

1

2

Этанол 50%-ный

340 (100)

400 (100)

Хлороформ

146 (43)

118 (29)

Диэтиловый эфир

26(8)

60 (15)

Ацетон

77 (23)

70 (17)

Использование 50%-ного этанола обеспечивает максимальную экстракцию полярных БАВ из растительных тканей.

Влияние среды экстрагирования на содержание антиоксидантов (мкг/г сухих растений) в экстракте. Отделение неразрушенных клеток и ядер проводят центрифугированием. Режим центрифугирования подби­рается индивидуально. Обычно для получения плазмы кровь центрифугируют со скоростью 3103 об/мин на цен­трифугах без охлаждения. Гомогенат ткани для энзимологических исследований центрифугируют со скоростью 7000–12000g при 0°С, в рефрижераторных центрифу­гах. Полученный после центрифугирования супернатант хранят в холодильнике при +4°С. Расчет объема супернатанта производят путем сложения величин объемов предварительно определенной в исследуемой раститель­ной или животной тканях гидровлаги и раствора, взято­го для экстракции ФАВ.

Качественный и количественный состав веществ, со­держащихся в супернатанте, определяют по стандарт­ным методикам. Следует придерживаться следующего правила при выборе методики: используемый метод дол­жен быть специфичным, т.е. исключать возможность побочных реакций, затрудняющих интерпретацию полученных результатов, и легко воспроизводимым.
^ Экстр акция БАВ из растительных тканей

Органы растений – листья, стебли, корни – предва­рительно разрезанные на мелкие части, измельчают на механической мельнице в порошок с размером частиц в 1–2 мм (см. рис.1). Вытяжку готовят путем настаива­ния порошка в 50%–ном этаноле в соотношении 1:20 (1 г растительного порошка настаивают на 20 мл 50%-ного этанола). Экстракцию проводят в течение 24 ч при тем­пературе воздуха +4 °С. Удаление неразрушенных час­тиц, клеток, ядер и прочего проводят путем фильтрова­ния тканевого гомогената или центрифугированием при 7000 g в течение 10–15 мин при температуре 2–4 °С. За­тем прозрачный раствор (фильтрат или супернатант) под­вергают химическим исследованиям.
^ Приготовление гомогената из растительных тканей

Целое растение или его часть после взвешивания под­вергают гомогенизированию путем механического расти­рания в ступке при постоянном охлаждении. Получен­ную однородную массу центрифугируют. Надосадочную жидкость подвергают исследованию.

Зерновки с влажностью 8–10% и другие сухие части растений измельчают на мельнице (2 г зерновок измель­чают в течение 1 мин). Полученный сухой порошок взве­шивают и растворяют в бидистиллированной воде или другой среде выделения, охлажденной до 0°С, в соотно­шении 1:3 (на 1 г зерновок добавляют 3 мл охлажденной среды выделения). После перемешивания исследуемый образец центрифугируют при 7000 g. Надосадочную жид­кость (супернатант) используют для биохимических ис­следований.
^ Получение плазмы и сыворотки крови

Забор крови производится из вены с помощью иглы или иглы со шприцем в центрифужную пробирку (пред­варительно пробирка промывается дистиллированной во­дой). Пробирка и игла должны быть сухими, во влажных может происходить гемолиз эритроцитов, что может по­влиять на результаты анализа. Кровь центрифугируют 15–20 мин со скоростью 3000 об/мин. В результате цент­рифугирования формируются два слоя: верхний, светло-желтый, – плазма, нижний, красный, состоит из фор­менных элементов крови. До начала биохимических ис­следований плазма крови хранится в холодильнике при температуре воздуха +4 °С.

Сыворотку крови получают после отстаивания крови в холодильнике при +4 °С в течение суток. После этого верхний слой жидкости осторожно сливают в чистую пробирку, не повреждая образовавшегося сгустка формен­ных элементов крови. Сыворотка крови отличается от плазмы тем, что в ней отсутствуют элементы свертыва­ния крови.
^ Приготовление гомогената из тканей животных

Свежую ткань печени или мышц предварительно мно­гократно промывают 0,9 % раствором NaCl (физио­логический раствор), охлажденным до 0°С, а затем обсу­шивают фильтровальной бумагой и измельчают ножница­ми. На весах взвешивают измельченную ткань и помещают в стакан для гомогенизирования. В случае, если исполь­зуется стеклянный гомогенизатор, зазор между стенкой и пестиком должен быть 0,2–0,3 мм; скорость вращения пестика не должна превышать 800 об/мин. Время измель­чения тканей: печень – 30–40 сек, мышцы – до 60 сек. Если используют механический гомогенизатор, скорость вращения ножей можно доводить до 900 об/мин. Все ра­боты необходимо проводить на холоде, помещая стакан гомогенизатора в чашку со льдом.

Разбавление при гомогенизировании должно прово­диться с учетом содержания определяемого биологиче­ски активного вещества. Так, в случае определения ак­тивности алкогольдегидрогеназы в печени используют разбавление 1:3 или 1:5 (на 1 г сырой ткани добавляют 3 или 5 мл охлажденной среды выделения).

Полученный тканевой гомогенат центрифугируют при 7000 g в течение 10–15 мин (t 0 °C). Надосадочную жидкость (супернатант) подвергают биохимическим исследо­ваниям.
^ Методики подготовки ФАВ исследуемых образцов

Экстракцию ФАВ из тканей лучше всего проводить при постоянном перемешивании смеси и температуре 0°С. Низ­кая температура среды позволяет исключить протекание химических процессов в гомогенатах ткани. По окончании экстракции удаляют не полностью разрушенные клетки и ядра путем центрифугирования или фильтрования. После центрифугирования надосадочную жидкость осторожно сли­вают, а осадок отбрасывают. Исследованию подвергаются вещества, содержащиеся в надосадочной жидкости. Для воспроизведения результатов исследования необходимо придерживаться точного описания методики эксперимента.
РАЗДЕЛ 1

^ РАБОТА № 1. ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Для обнаружения белков существует две группы реакций: цвет­ные реакции и реакции осаждения.

Цветные реакции на белки являются реакциями на структурные элементы белка — аминокислоты или образуемые ими химические группировки. При взаимодействии белка с отдельными химичес­кими веществами возникают окрашенные продукты реакции, обус­ловленные присутствием в белках определенных аминокислот и группировок.
^ 1.1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)

Реакция обусловлена наличием в белках пептидных связей, соединяющих остатки аминокислот в молекуле белка путем отнятия элементов частицы воды из — СООН-группы одной аминокислоты и —NH2- группы другой:



В сильно щелочной среде в присутствии сернокислой меди об­разуются комплексные соединения меди с пептидной группиров­кой, окрашенные в красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.

Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а также продукты их неполного гидролиза — пептоны и полипепти­ды. Для ди- и трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок окрашивания зависит от длины пептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или красное окрашивание. Биурето­вая реакция положительна и с веществами небелкового характе­ра, имеющими в своем составе не менее двух —СО—NH2-групп, к ним относятся, например, оксамид — H2N—CO—CO—NH2, биурет —H2N—CO—NH—CO—NH2, по которому и названа реакция.

^ Реактивы и материалы: раствор яичного белка, гидроксид натрияий, 10% раствор, сернокислая медь, 1% раствор
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   17

Похожие:

Биохимия лабораторный практикум iconОбщая стратиграфия лабораторный практикум
Общая стратиграфия: Лабораторный практикум /Юж. Рос гос техн ун-т. Новочеркасск: юргту, 2003. с
Биохимия лабораторный практикум iconРасписание
Лабораторный практикум по бухгалтерскому учету. Зачет. Прием контрольных работ. Ст преп. Бабенко Я. Н./ 1,2,3 гр. Ко
Биохимия лабораторный практикум iconБиохимия. Темы акр
Биохимия мышц. Особенности строения поперечнополосатой, сердечной и гладкой мускулатуры
Биохимия лабораторный практикум iconЛабораторный практикум по бухгалтерскому (финансовому) учету. Сквозная обобщающая задача
Рассчитать фактическую себестоимость выпущенной из производства готовой продукции
Биохимия лабораторный практикум iconОрный практикум по курсу “ Основы промышленной экологии электрохимических...
...
Биохимия лабораторный практикум iconМосковский государственный университет технологий и управления
Лабораторный практикум для студентов механических, технологических и экономических специальностей всех форм обучения
Биохимия лабораторный практикум iconРоссийский университет кооперации
Лабораторный практикум по бухгалтерскому учету (сквозная задача по финансовому, управленческому учету) и аудиту
Биохимия лабораторный практикум icon2. Теоретические сведения 5 Вопросы для самоконтроля 8
Б 825 Лабораторный практикум по курсу «Информационные технологии в менеджменте» (часть 1)/ А. Н. Борисов; Тула: Тул гос ун-т. 2012....
Биохимия лабораторный практикум iconПлан издательской деятельности гбоу впо спхфа минздравсоцразвития России на 2012 г
Фармацевтическая химия. Лабораторный практикум для студ. 4 курса заочного отделения
Биохимия лабораторный практикум icon2. Вставка диаграмм 15 Вопросы для самоконтроля 16
...
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2015
контакты
userdocs.ru
Главная страница