Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны»


Скачать 221.58 Kb.
НазваниеУчебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны»
Дата публикации23.07.2013
Размер221.58 Kb.
ТипУчебно-методическое пособие
userdocs.ru > Культура > Учебно-методическое пособие
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме:

«Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны»
Методическое пособие разработано на кафедре патофизиологии лечебного факультета МГМСУ в соответствии с планом реализации Проекта №2 «Клеточные биотехнологии в современной медицине» инновационно-образовательной программы «Разработка и внедрение в образовательный и лечебный процессы МГМСУ инновационных здоровье- и ресурсосберегающих технологий»
Цель занятия: Знакомство с теоретическими и практическими основами культивирования клеток, и моделирование повреждения клеточной мембраны.

^ Культивирование клеток

(Теоретическая часть занятия)
Культивирование клеток тканей впервые было разработано в начале прошлого века (Harrison, 1907; Carrel, 1912) как метод для изучения in vitro структурных и функциональных изменений клеток, которые могут происходить, как в нормальном организме, так и при развитии той или иной патологии.

Термин культура клеток тканей обозначает методы культуры органов и культуры клеток. Термин культура органов подразумевает трехмерную культуру недезагрегированной ткани, которая сохраняет некоторые или все гистологические особенности ткани in vivo. Термин культура клеток имеет отношение к культуре дисперсионных (изолированных) клеток, полученных из первичной ткани или из клеточного штамма ферментным, механическим или химическим дезагрегированием.

Интерес медицинской науки к культуре клеток животных связан с возможностью изучения патологических процессов на клеточном и молекулярном уровне, с возможностью разработки новых способов диагностики и эффективных методов лечения. Интерес к ткани человека и человеческим клеточным линиям (например, HeLa) связан с необходимостью вирусологов и молекулярных генетиков работать именно на человеческом материале. Как только были разработаны различные бессывороточные среды для культивирования клеток, таких как эпидермальные кератиноциты, бронхиальный эпителий и сосудистый эндотелий, культивирование клеток человека приобрело широкое распространение.

Культуры клеток и тканей имеют уникальные преимущества при исследовании:

(1) внутриклеточной активности процессов репликации и транскрипции ДНК, синтеза белка, энергетического обмена и метаболизма лекарственных веществ;

(2) внутриклеточных изменений локализации комплексов рецептора и гормона, сигнальной трансдукции, проводимости мембраны;

(3) взаимодействия с окружающей средой, цитотоксичности, канцерогенеза, взаимодействия с лекарствами и взаимодействия лиганд – рецептор;

(4) межклеточных взаимодействий, например, морфогенеза, паракринного контроля, пролиферации, адгезии и подвижности клетки, моделей для медицинского протезирования;

(5) генетики, включая исследование генома в норме и при патологии;

(6) продуктов секреции клетки и,

(7) при разработках клеточных биотехнологий.

Разработка методов культивирования клеток в значительной степени была обязана двум направлениям медицинских исследований: производству противовирусных вакцин и изучению патогенеза неоплазии. Стандартизация линий клеток и возможность культивирования большого количества клеток обеспечили необходимые условия для развития современных медицинских клеточных биотехнологий, например, технологий получения больших количеств гормона роста человека, инсулина и интерферона генетически модифицированными прокариотическими и эукариотическими клетками или использование культуры стволовых клеток человека для получения культуры нейронов. Культура клеток значительно способствовала изучению иммунологии и проникновению в суть механизма действия антител. Благодаря культуре клеток был достигнут большой прогресс в изучении клеточных взаимодействий и механизмов контроля дифференцировки и развития.

Технология культуры клеток имеет широкое распространение в медицине. Например, хромосомный анализ клеток, полученных из матки, с помощью амниоцентеза, помогает диагностировать генетические нарушения у ребенка в чреве матери. Кроме того, в анализах in vitro может быть установлено качество питьевой воды и могут быть измерены токсические эффекты фармацевтических веществ и загрязняющих агентов окружающей среды. Большие перспективы использования культивирования клеток при решении медицинских проблем возникли после того, как было показано, что культуры эпидермальных клеток формируют функционально дифференцированные слои, а эндотелиальные клетки могут образовывать капилляры. Это создало предпосылки для разработки клеточных биотехнологий в аллотрансплантации и реконструктивной хирургии, с использованием собственных клеток пациента, особенно при серьезных ожогах. Биотехнологии вставки нормальных генов в генетически дефектные клетки позволили пересаживать такие “скорректированные” клетки обратно в организм с терапевтическими целями. Например, доказана техническая возможность трансфекции (вставки) нормального гена инсулина в культивируемые in vitro β-островные клетки (инсулоциты), предварительно, полученные от больного диабетом. Также показана возможность пересадки нормальных эмбриональных нейронов пациентам с болезнью Паркинсона.
^ ПРЕИМУЩЕСТВА КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК ТКАНЕЙ
Контроль окружающей среды. Наиболее важными преимуществами культуры клеток и тканей являются возможность контролировать физико-химические условия окружающей среды (рН, температура, осмотическое давление и напряжение О2 и СО2) и физиологические условия (концентрация питательных веществ). Однако большинство линий клеток нуждаются в добавлении среды с сывороткой и других компонентов.

^ Характеристика и гомогенность образца. Образцы ткани являются гетерогенными. Репликаты (разные участки ткани), даже от одного органа могут сильно отличаться по типу и составу клеток. После одного или двух пассажей (пересадка клеток с заменой среды), культивированные линии клеток принимают гомогенную конституцию, поскольку в каждой пересадке клетки перемешиваются случайным образом. Поэтому в каждой культуре любая выборка будет идентичной другой выборке и характерные черты данной линии будут сохраняются в течение нескольких поколений.

^ Экономия, деньги и механизация. Культуры клеток могут быть подвергнуты действию реагента в контролируемой концентрации с непосредственным контактом реагента с клетками. Поэтому, будет требоваться меньшее реагента, чем для инъекции in vivo, где 90% реагента утрачивается при выделении и в результате распределения по разным тканям. Скрининг на культуре клеток является более дешевыми. При этом удается избежать нравственных вопросов экспериментов на животных. Кроме того, использование многолуночных планшет и робототехники позволяет достигать значительной экономии по времени и в деньгах.

^ Моделирование условий in vivo. Регулирование дозы и продолжительности воздействия различных веществ и метаболического состояния культуры, а также воспроизведение гистотипических и органотипических особенностей увеличивает точность in vivo моделирования.
^ ОГРАНИЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК
Компетентность. Поскольку клетки животных растут гораздо медленнее, чем многие распространенные бактерии, плесень и дрожжи, культивирование клеток необходимо проводить в асептических условиях. Кроме того, клетки из многоклеточных животных обычно не выживают в изоляции и, поэтому при культивировании нуждаются в окружающей среде, имитирующей плазму крови или интерстициальную жидкость. Создание этих условий требует от экспериментатора компетентности, позволяющей оценить потребности данной культуры клеток. Перед началом экспериментов на культуре клеток, экспериментатор, также должен провести процедуру распознавания клеток по экспрессии маркеров и/или по гистологическим и цитологическим особенностям.

Количество. Главным ограничением культуры клеток является затрата больших усилий и материалов, необходимых для производства сравнительно небольшого количества ткани. Эти расходы могут быть минимизированы, за счет составления грамотного протокола эксперимента и за счет использования робототехники и автоматизации процессов.

^ Утрата способности к дифференцировке и отбор. Когда были достигнуты первые значительные успехи в культивировании клеток в 1950 г, исследователи обратили внимание на утрату фенотипических особенностей, характерных для клеток, когда они находились в органе или ткани. Этот эффект утраты способности к дифференцировке обусловлен чрезмерно быстрым ростом клеток в культуре. В настоящее время, однако, благодаря использованию специфических сред стало возможным поддержание дифференцированных черт клеток в течение длительного времени.

^ Происхождение клеток. Если специфические особенности клеток утрачиваются, становиться сложным переносить закономерности обнаруженные в культуре клеток на функционирование клеток в составе ткани, из которой они были получены. Для характеристики клеток требуются устойчивые маркеры; кроме того, может появиться необходимость в модификации клеток, для того чтобы эти маркеры появились.

Неустойчивость. Насущной проблемой многих линий клеток является их неустойчивость, которая вытекает из их изменчивого анеуплоидного хромосомного строения. Даже у краткосрочных культур нетрансформированных клеток гетерогенность в способности к дифференцированию в пределах одной популяции может порождать выраженные изменения от одного пассажа к другому.

^ Важные различия клеток in vitro и in vivo. Многие из различий в поведении культивируемых клеток и клеток in vivo являются результатом диссоциации клеток из трехмерной организации в двухмерную (размножение на плоскости). Специфические взаимодействия клеток характерные для ткани утрачиваются, клетки становятся подвижными и начинают пролиферировать. По этой причине рост части популяции клеток увеличивается. Линия клеток формируется из одного или двух типов клеток, поэтому многие гетеротипические межклеточные взаимодействия утрачиваются.

Окружающая культуру клеток среда также нуждается в некоторых компонентах, вовлеченных в регуляцию гомеостаза in vivo. В основном это факторы нервной и эндокринной систем. Без этих факторов клеточный метаболизм in vitro не будет отражать реальные изменения метаболизма клеток в составе органа или ткани in vivo. Понимание этого факта привело к включению различных гормонов в среду культивирования.

Энергетический обмен in vitro осуществляется в значительной степени посредством гликолиза, и, несмотря на то, что цикл Кребса по-прежнему функционирует, in vitro он играет меньшую роль, чем in vivo.

Многочисленные различия между условиями окружающей среды клетки in vitro и in vivo часто были причиной скептического отношения к культуре клеток. При этом, однако, признается, что многие специализированные функции в культуре клеток сохраняются. Поэтому, с учетом перечисленных ограничений, культивирование клеток представляет собой весьма информативный методический подход для изучения клеточной биологии.
^ Типы культур клеток тканей
Существует два основных типа культуры клеток тканей: органная культура и культура клеток.

(1) Органная культура сохраняет, по крайней мере, частично характерные особенности архитектуры ткани in vivo. Ткань органа культивируется на поверхности раздела жидкость - газ (на плоту, решетке или геле), что благоприятствует сохранению сферической или трехмерной формы. Вследствие сохранения клеточных взаимодействий, встречающихся в ткани, из которой была получена культура, органные культуры сохраняют отличительные черты этой ткани. Эта культура не может размножаться. В отличие от культуры клеток, каждый эксперимент с органной культурой требует нового культивирования. Поэтому количественный анализ является более сложным. Тем не менее, органные культуры сохраняют гистологические взаимодействия, без которых сложно воспроизводить характерные особенности ткани.

(2) ^ Культура клеток подразумевает культивирование изолированных клеток на твердой подложке в состоянии монослоя или как суспензия в среде культивирования. Культуры клеток могут быть получены из ткани или дисперсионных суспензий клеток. Деление клеток в условиях культуры клеток происходит значительно быстрее, чем в органной культуре. Благодаря этому возможно быстрое воспроизведение линий клеток. Клеток монослоя или суспензии могут быть перенесена, или другими словами субкультивированна, в новую посуду. Это процесс называется термином «пассаж». Дочерняя культура, полученная таким образом, дает начало линии клеток.

^ Повреждающее действие пероксида водорода на

клетку (перитонеальный макрофаг)

(Практическая часть занятия)
Цель опыта: приобрести навыки выделения и работы с первичной культурой клеток. Изучить влияние повреждающего действия активных форм кислорода на мембранные структуры клетки.
Приборы и материалы: 1 мышь весом 15-20 гр., лоток, бикс, препаровальный столик, булавки, ножницы глазные, пинцет анатомический, шприц инсулиновый, шприц 5 мл, камера Горяева, микроскоп, пипетки лабораторные, штативы пробирочные и для эппендорфов, эппендорфы, маркер.
Реактивы: физиологический раствор, хлоралгидрат из расчета 35 мг/100 г веса, синь трепановая, пероксид водорода 3%, бензоат натрия.
Ход работы:
1. Наркотизируем мышь.

Для этого берем мышь большим и указательным пальцами за хвост, ближе к основанию и сажаем ее на клетку или ровную поверхность. Прижимаем мышь безымянным пальцем, приподнимаем хвост и делаем укол инсулиновым шприцом (0,1 мл р-ра хлоралгидрата) в нижнюю часть живота, стараясь не проникать иглой глубоко.
2. Закрепляем мышь на препаровальном столе булавками. Пинцетом аккуратно подхватываем и приподнимаем шкурку немного ниже грудины.



3. Ножницами делаем надрез и аккуратно удаляем волосистый покров с брюшка.

4. Прокалываем иглой (5 мл шприца) брюшину и вводим 5 мл физ. раствора, не вынимая иглу.







5. Массируем пальцами брюшную полость в течение 1,5-2 минут.

6. Откачиваем шприцом жидкость.







  1. Собранную взвесь клеток центрифугируем 4 мин при 1000 оборотов/мин

  2. Удаляем надосадочную жидкость пипеткой, доводим объем до 1 мл физ раствором, затем пипетируем (взбалтываем пипеткой) взвесь клеток. Эта взвесь клеток представляет собой ^ ПЕРВИЧНУЮ КУЛЬТУРУ КЛЕТОК.

  3. Помечаем эппендорфы: контроль 1/1 как «К1/1», контроль 2/1 как «К2/1», пероксид водорода 1/1 как «ПВ1/1» и пероксид водорода 2/1 как «ПВ2/1». Собираем камеру Горяева.

  4. Отливаем пипеткой 100 мкл взвеси клеток в эппендорф с пометкой контроль 1/1, добавляем 100 мкл раствора бензоата натрия и ждем 2 минуты. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева (См. ПРОТОКОЛ ниже). Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток. Результаты записываем в тетрадь.

  5. Отливаем пипеткой 67 мкл взвеси клеток в эппендорф с пометкой контроль 2/1, добавляем 134 мкл раствора бензоата натрия и ждем 2 минуты. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток. Результаты записываем в тетради.

  6. В третий эппендорф с пометкой пероксид водорода 1/1 наливаем 100 мкл взвеси клеток+ 100мкл р-ра пероксида водорода, ждем 2 минуты. Таким образом, на клетки действует 1.5% пероксида водорода. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток и отмечает соотношение прокрашенных и непрокрашенных клеток. Результаты записываем в тетрадь.

  7. В четвертый эппендорф с пометкой пероксид водорода 2/1наливаем 67 мкл взвеси клеток+ 134 мкл р-ра перекиси водорода, ждем 2 минуты. Таким образом, на клетки действует 2% пероксида водорода. После этого добавляем 200 мкл р-ра трепановой сини и пипетируем. Затем сразу помещаем каплю суспензии клеток в один из карманов камеры Горяева. Наблюдаем при малом увеличении (объектив х10, окуляр х10 или х15) микроскопа количество окрасившихся клеток и отмечает соотношение прокрашенных и непрокрашенных клеток. Результаты записываем в тетрадь.


Нормальные макрофаги (указано стрелкой) Поврежденные макрофаги (указано стрелкой)

ПРОТОКОЛ «Микроскопический подсчет живых клеток»
В образец клеток добавляется трипановый синий, краситель, который не проникает в живые клетки, но окрашивает мертвые клетки в темно-синий цвет. Затем клетки помещаются на специальное стекло с нанесенной решеткой, которое называется гемоцитометр (или камера Горяева), и количество клеток подсчитывается вручную под микроскопом.

Материалы


● Гемоцитометр (камера Горяева), который необходимо каждый раз мыть и просушивать.

● Покровное стекло для гемоцитометра (многократно используемое), которое нужно мыть и просушивать после каждого использования.

● 0,4% трипановый синий (масса/объем).

● Счетчик, для подсчета клеток

● Клетки в суспензии, либо культура, растущая в суспензии. Перемешайте хорошо суспензию, чтобы получить репрезентативный образец.

● Пипеточные дозаторы, наконечники.

● Микроцентрифужные пробирки.

● Фазово-контрастный микроскоп, прямой или инвертированный, с 10Х объективом.

● Стерильная среда для разведения клеток.

Процедура





  1. Поместите покровное стекло ровно на середину гемоцитометра.




РИСУНОК. Подсчет клеток с помощью гемоцитометра. Клетки загружаются в обе камеры гемоцитометра с каждой стороны центрального желобка (а). При осмотре стекла с помощью 10Х объектива (общее увеличение 100Х), каждый 1 мм квадрат решетки будет занимать все поле зрения. Каждый 1 мм квадрат разделен на 25 более мелких квадратов (b). Каждый из 25 квадратов разделен на 16 мелких квадратиков, для облегчения подсчета мелких клеток или небольшого числа клеток (с). Для вычисления количества клеток на мл используется результат подсчета количества клеток в 1 мм квадрате.
Плохое суспензирование и недостаточное перемешивание образца перед помещением в камеру является основной причиной ошибок при подсчете клеток с помощью гемоцитометра.



  1. Перенесите 500 мкл клеток и среды в микроцентрифужную пробирку. Если объем образца небольшой, возьмите 200 мкл.

  2. Перенесите в микроцентрифужную пробирку 200 мкл взвеси клеток и 200 мкл трипанового синего. Закройте пробирку и перемешайте.

  3. Отберите 50 мкл смеси клеток с трипановым синим с помощью пипеточного дозатора. Добавьте 20 мкл с каждой стороны покровного стекла, позволяя капле, образовавшейся на кончике пипетки, проникнуть под стекло под действием капиллярных сил. (Если у вас два различных образца, можно аккуратно поместить по одному с каждой стороны.) Заполните оба отсека камеры, даже если у вас только один образец, иначе подсчет может оказаться неточным.


Если вы насчитываете менее 30 клеток, вы можете увеличить концентрацию образца с помощью центрифугирования аликвоты и повторного разведения в меньшем объеме, но обычно этого можно не делать. Проведите три независимых подсчета, чтобы более точно оценить количество клеток.


  1. Немедленно поместите гемоцитометр под микроскоп и под малым увеличением наведите его на решетку гемоцитометра. Проведите подсчет в любой 1 мм2 области, поэтому сдвиньте поле зрения к углу и переведите микроскоп под большее увеличение, чтобы одна решетка полностью заняла все поле зрения. Вы можете проводить подсчет и под малым увеличением, но при этом сложнее отличать мертвые клетки от живых. Если вы используете инвертированный микроскоп, поднимите объектив, чтобы на образец падало больше света – это существенно улучшит картину.


Чтобы не сосчитать одну и ту же клетку дважды, считайте только клетки, которые находятся наверху и слева от линий в каждом квадрате, и не считайте клетки, лежащие справа и снизу от линий в каждом квадрате. Единообразный подсчет, который каждый раз проводится одинаковым способом, единственный способ получить воспроизводимые результаты.


  1. Грубо подсчитайте клетки в 1 мм области, состоящей из 25 квадратов, чтобы понять, требуется ли увеличить или уменьшить концентрацию клеток. В идеале, в 1 мм должно находится от 30 до 300 клеток. Если клеток больше, приготовьте разведение 1:5 или 1:10.

  2. Подсчитайте живые клетки в 1 мм квадрате. Мертвые клетки будут окрашены в синий цвет, а живые клетки окрашены не будут (хотя могут иметь голубое кольцо или выглядеть зернистыми). Удобно пользоваться двухканальным счетчиком, так чтобы можно было одновременно считать мертвые и живые клетки, и получить процент живых клеток.


Если результаты подсчета сильно отличаются друг от друга, скажем, более чем на 20%, это может говорить о недостаточно качественном разведении клеток или образовании кластеров клеток.


  1. Подсчитайте суммарное количество клеток в трех различных 1 мм квадратах и разделите его на 3, чтобы получить среднее значение количества клеток в 1 мм квадрате.

  2. Вычислите количество клеток в 1 мл. Среднее количество клеток в 1 мм квадрате Х 10,000 Х разведение образца = количеству клеток в 1 мл исходного образца.


Пример:

Результаты вашего подсчета составили 113, 99 и 118 (среднее значение 110).

110 Х 10,000 = 1,1 Х 106 клеток/мл

Если вы смешали 200 мкл клеток с 200 мкл трипанового синего, степень разведения равна 2.

2 Х 1,1 = 2,2 Х 106

2,2 Х 106 клеток/мл соответствует количеству клеток в исходной культуре.


  1. Вычислите процент живых клеток в исходной культуре. Разделите количество живых клеток в трех 1 мм квадратах на общее число живых и мертвых клеток в трех 1 мм квадратах и умножьте на 100.


Показатель жизнеспособности меньший, чем 80-90% указывает на больную популяцию клеток. Чаще всего это говорит об избыточной плотности культуры, о повреждении клеток, но также может указывать на заражение или некачественную среду или сыворотку.

^ Делаем выводы и записываем в тетрадь:
Методические указания

к практическому занятию по теме:

«Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны»

(для преподавателей)
^ Содержание занятия:

Длительность занятия на вечернем факультете – 2 академических часа (1 час 40 минут)

на дневном факультете – 3 академических часа (2 часа 30 минут)

вечерний факультет:

  • Проверка списочного состава группы – 5 минут

  • Теоретическая часть: разбор теоретических вопросов – 25 минут

  • Практическая часть (опыт) – 60 минут

  • Обсуждение – 10 минут


дневной факультет:

  • Проверка списочного состава группы – 5 минут

  • Теоретическая часть – 50 минут

  • Перерыв – 20 минут

  • Практическая часть (опыт) – 60 минут

  • Обсуждение – 15 минут


Ход работы:
^ ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

(вечерний факультет – 25 минут, дневной – 50 минут)
Рекомендуется разобрать следующие вопросы:

  • Определение понятия «повреждение клетки».

  • Виды повреждающих воздействий, повреждения клетки.

  • Патофизиологические механизмы ответа клетки на повреждающее воздействие.

  • Исходы повреждающих воздействий на клетку.

  • Методики моделирования повреждений клетки.


Блок - информации

Повреждение клетки - нарушение структур и/или функций клеток, которое сохраняется некоторое время после удаления действующего фактора.

Различают:

  1. Обратимые повреждения. При этом, воздействие приводит к нарушению функционирования клетки, но не приводит к лизису.

Выделяют стадии: альтерации, восстановления.

  1. Необратимые повреждения. Приводят к лизису клетки.

Выделяют стадии: альтерации, агонии, смерти, элиминации.
^

Виды повреждающих факторов:


  • Физические: механические воздействия, температура, излучения и т.п.

  • Химические: кислоты, щелочи и др. химически активные в-ва.

  • Биологические: вирусы, плазмиды, бактерии и др.

  • Иммунологические (комплексы АГ-АТ, комплемент)
^

Проявления повреждения клетки:


  • Повышение проницаемости мембраны, снижение мембранного потенциала.

  • Денатурация белков, инактивация ферментов.

  • Нарушение клеточной энергетики и биосинтеза.

  • Выход во внеклеточное пространство медиаторов повреждения.

  • Нарушения структур цитоскелета.

  • Повреждение структур ядра, ДНК.



^

Отличительные особенности свободных радикалов


  • наличие неспаренного электрона на внешнем энергетическом уровне;

  • собственный магнитный момент;

  • высокая химическая активность и малое время жизни;

  • способность инициировать цепные реакции окисления;

Наиболее вероятно появление свободных радикалов в организме при последовательном присоединении электронов к кислороду и во время свободно-радикального перекисного окисления липидов.

 
^

Основные процессы, ведущие к образованию свободных радикалов в организме 


  • последовательное присоединение электронов к кислороду в присутствии металлов переменной валентности;

  • микросомальное и митохондриальное окисление, фагоцитоз;

  • ферментативные реакции с участием гидролаз, оксидаз, дегидрогеназ;

  • реакции автоокисления и биосинтеза (тиолы, катехоламины и т.д.);

  • окисление чужеродных соединений – ксенобиотиков, некоторых лекарственных препаратов;

  • действие негативных факторов среды (физические и химические инициаторы окисления);

  • фотохимические процессы;

  • перекисное окисление липидов;
^

Наиболее распространенные в организме формы свободных радикалов 


  • АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА: О*2- супероксидный анион радикал;
    'O2- синглетная форма кислорода;
    OH* - гидроксильный радикал;
    Н2О2- перекись водорода;

  • ^ ОКИСЛЕННЫЕ ГАЛОГЕНЫ: CLO*- гипохлорид, хлорамины;

  • ОКИСЛЫ АЗОТА: NO*- оксид азота;

  • СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ, ОБРАЗУЮЩИЕСЯ ПРИ ПЕРЕКИСНОМ ОКИСЛЕНИИ ЛИПИДОВ: RO*, RO2*- моно-, димерные, полимерные, циклические, алкоксильные и перекисные радикалы жирных кислот.
^

Образование активных форм кислорода и перекисное окисление липидов 


 Согласно современным представлениям, многие жизненно важные метаболические и физиологические процессы, протекающие в организме, тесно связаны со свободно-радикальным окислением.


^ ОСНОВНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

ВОССТАНОВЛЕНИЕ КИСЛОРОДА

ПЕРИКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ

СХЕМА ОКИСЛЕНИЯ





^ ИНИЦИАТОРЫ ОКИСЛЕНИЯ

Доноры е*, цитохромы, НАДФ-Н, радиация, металлы переменной валентности, оксигеназы, оксидазы, пероксидазы и др.

Активные формы кислорода, металлы переменной валентности, облучение, окислители

^ СВЕЧЕНИЕ СПЕКТР (нм)

УСИЛИВАЮТ

   
УГНЕТАЮТ

400-420, 560-770, 860-1300
люминол, люцегенин 
перехватчики активных форм кислорода (тиомочевина, манит, этанол, азиды, каротин, гистамин,метионин и др.) 

360-800
инициаторы перикисного окисления 

 

антиоксиданты, избыток ионов двухвалентного железа, недостаток кислорода 

 

^ ЗНАЧЕНИЕ СВОБОДНО- РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ

В НОРМЕ: НЕОБХОДИМОЕ ЗВЕНО МЕТАБОЛИЗМА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕЕ НОРМАЛЬНУЮ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ

^ ПРИ ПАТОЛОГИИ: УНИВЕРСАЛЬНАЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ОСНОВА ПАТОГЕНЕЗА РАЗЛИЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

  • МОДИФИКАЦИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН;

  • ^ ЗАЩИТНЫЕ ФУНКЦИИ, ОКИСЛЕНИЕ ЧУЖЕРОДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, МИКРОБИЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ;

  • ОБМЕН ВЕЩЕСТВ, АККУМУЛЯЦИЯ И БИОТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ;

  • ВЛИЯНИЕ НА ИММУНИТЕТ, ПЕРЕДАЧУ ИНФОРМАЦИИ;

  • ^ НАРУШЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ, СТРУКТУРЫ, ФУНКЦИИ БИОМЕМБРАН;

  • ПОВРЕЖДЕНИЕ БЕЛКОВ, ЛИПИДОВ, НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И Т.Д.;

  • НАРУШЕНИЕ БИОЭНЕРГЕТИКИ, РЕГУЛЯТОРНЫХ И ЗАЩИТНЫХ ФУНКЦИЙ;

  • ^ ОБЩЕТОКСИЧЕСКОЕ И КАНЦЕРОГЕННОЕ ДЕЙСТВИЕ;


Избыток свободных радикалов и перекисных продуктов вызывает структурные и функциональные повреждения биологических мембран. 

^ Регуляция свободно - радикального окисления.

Скорость СРО и содержание свободных радикалов в организме в норме поддерживается на определенном уровне сложной, многоступенчатой системой регуляции. В ней можно условно выделить специфические и неспецифические факторы, значение и вклад которых меняется на различных стадиях окисления. 


^ РЕГУЛЯЦИЯ СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ

НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

  • МЕХАНИЗМЫ, РЕГУЛИРУЮЩИЕ КОЛИЧЕСТВО И КАЧЕСТВО СУБСТРАТА ОКИСЛЕНИЯ И ЕГО ДОСТУПНОСТЬ;

  • ^ ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА ИНИЦИАТОРЫ ОКИСЛЕНИЯ, В ЧАСТНОСТИ, НА СОСТОЯНИЕ МЕТАЛЛОВ ПЕРЕМЕННОЙ ВАЛЕНТНОСТИ;

  • ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕМБРАН;

  • ^ МЕХАНИЗМЫ, ПОДДЕРЖИВАЮЩИЕ НИЗКОЕ СОДЕРЖАНИЕ О2 В ТКАНЯХ;

СПЕЦИФИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

  • ФЕРМЕНТЫ, ОТВЕТСТВЕННЫЕ ЗА ОБРАЗОВАНИЕ И МЕТАБОЛИЗМ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА (СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА, КАТАЛАЗА И ДР.);

  • ^ СИСТЕМЫ, УТИЛИЗИРУЮЩИЕ ПЕРЕКИСНЫЕ ПРОДУКТЫ (ГЛУТАТИОН-ПЕРОКСИДАЗА, ГЛУТАТИОН-РЕДУКТАЗА И ДР.);

  • ПЕРЕХВАТЧИКИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА (МЕТИОНИН, ГИСТАМИН И Т.Д.)

  • ^ БИОАНТИОКСИДАНТЫ (ТОКОФЕРОЛ, УБИХИНОН, ЦЕРУЛОПЛАЗМИН И ДР.);

СКОРОСТЬ ОКИСЛЕНИЯ ПОДДЕРЖИВАЕТСЯ НА ПОСТОЯННОМ УРОВНЕ СЛОЖНОЙ, МНОГОСТУПЕНЧАТОЙ СИСТЕМОЙ РЕГУЛЯЦИИ

 
^ Основные причины изменения стационарного состояния свободно-радикального окисления в организме 

  • избыточное появление инициаторов свободно-радикального окисления;

  • снижение эффективности механизмов регуляции свободно-радикального окисления;

  • количественные и качественные изменения субстрата окисления, его доступности и способности подвергаться окислению.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ (опыт) (вечерний факультет – 60 минут, дневной – 60 минут)
ОБСУЖДЕНИЕ (вечерний факультет – 10 минут, дневной – 15 минут)
Стимулировать студентов высказаться по следующим вопросам:

1. К каким патологическим состояниям, заболеваниям может иметь отношение, воспроизводимое на занятии, оксидативное повреждение клеток, и в частности макрофагов?

2. Какие механизмы привели к гибели макрофагов в нашем эксперименте?

3. Какие способы и подходы вы могли бы предложить для выделения макрофагов у человека здорового и больного.

4. Как бы вы могли использовать выделенные от здорового или больного человека макрофаги, с диагностической, терапевтической или какой другой целью?

5. Понимая патофизиологические механизмы повреждения и гибели макрофагов, как бы вы могли защитить клетки от оксидативного повреждения? (инновационный вопрос, направленный на генерацию новых знаний. Дать возможность студентам для любой фантазии и предположений и гипотез. )

Если, студенты затрудняются с ответом, можно подсказать возможные направления защиты, например: 1. усиление антиоксидантных свойств клетки (каким образом?); 2. повышение устойчивости мембран (каким образом); 3. повышение внутриклеточной системы защиты (каким образом?); 4. нейтрализация свободных радикалов и активных форм кислорода (перекиси водорода) (каким образом? ловушка, разрушение и т.д.)




Похожие:

Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие
Свободное Дыхание: Учебно-методическое пособие / С. В. Васильев; Ивановская государственная медицинская академия Иваново, 1996. с....
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие 032700 «Филология»
История зарубежной литературы Средних веков и эпохи Возрождения: Учебно-методическое пособие / Авт. Я. В. Погребная. – Ставрополь:...
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие для студентов очной формы обучения
Настоящее учебно-методическое пособие разработано на основании Государственного образовательного стандарта высшего профессионального...
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconОбразовательная программа «Государственная молодежная политика» Учебно-методическое...
Учебно-методическое пособие предназначено для использования в целях повышения квалификации работников сферы государственной молодежной...
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие к практическим занятиям по биологической химии
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов лечебного и медико-профиоактического факультетов медицинских вузов, выполняющих...
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие для студентов, обучающихся по специальности 030601 «Журналистика»
Актуальные проблемы современной науки и журналистика: учебно-методическое пособие. – Ставрополь: Изд-во сгу, 2011. – с
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие очерчивает основной круг вопросов, исследуемых...
Волкова В. В. Имиджелогия. Учебно-методическое пособие. – Ставрополь: СевКавгту, 2005. – 168 с
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconУчебно-методическое пособие по изучению курса «Уголовно-процессуальное право рф: Общая часть»
Учебно-методическое пособие предназначено для проведения семинарских занятий по изучению Общей части уголовного процесса. В него...
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconМетодические рекомендации по выполнению практических навыков по хирургии...
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов V курса лечебного факультета и субординаторов-хирургов
Учебно-методическое пособие к практическому занятию по теме: «Культивирование клеток и моделирование повреждения клеточной мембраны» iconКафедра государственного, муниципального управления и социологии...
Политология: учебно-методическое пособие для вузов / А. Г. Воржецов, Е. В. Храмова [и др.] / под ред. А. Г. Воржецова, Е. В. Храмовой...
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2015
контакты
userdocs.ru
Главная страница