Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК


НазваниеПрактическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК
страница2/5
Дата публикации12.04.2013
Размер0.62 Mb.
ТипДокументы
userdocs.ru > Химия > Документы
1   2   3   4   5

После того как сайт посадки полифункционального фермента узнается S-субъединицей, происходит связывание фермента с ДНК, что сопровождается либо ее рестрикцией, либо модификацией; активности, проявляемые субъединицами R и М являются взаимоисключающими.


Рестриктаза Eco K имеет молекулярную массу около 400.000 дальтон. Она содержит две R-субъединицы (по 135.000 дальтон, каждая), две M-субъединицы (по 62.000 дальтон) и одну S-субъединицу (55.000 дальтон).

Рестриктаза Eco B состоит из субъединиц такого же размера, но их молярное соотношение в составе фермента может быть различным. Субъединицы M и S в соотношении 1:1 могут сформировать комплекс, который проявляет функцию метилирования независимо от рестриктазной активности. Данное явление легко объяснимо, поскольку три гена, кодирующие каждую из субъединиц, расположены в опероне в следующем порядке: P1 – hsdRP2 – hsdMhsdS, где Р1 и Р2 – независимые промоторы. Отсюда следует, что гены hsdM и hsdS могут экспрессироваться независимо от hsdR.

Сайты узнавания ферментов Eco B и Eco K - это структуры, состоящие из двух частей. В обоих случаях первая часть представлена специфической последовательностью из трех пар оснований, отделенной у фермента Eco B восемью парами, а у Eco K - шестью парами оснований от специфической последовательности из четырех пар оснований:



TGANNNNNNNNTGCT

ACTNNNNNNNNACGA



Как можно видеть, оба сайта узнавания несимметричны, однако каждый из них несет на каждой из цепей по одному остатку аденина для метилирования, как показано звездочками в последовательности сайта узнавания для фермента Eco B.

Будет ли данная ДНК разрезана или модифицирована, определяется состоянием сайта-мишени. Если сайт-мишень полностью метилирован, фермент может связаться с ним, но затем диссоциировать без проявления любой из своих активностей. Если мишень полуметилирована, фермент модифицирует неметилированную цепь; благодаря этому сохраняется состояние метилирования в ДНК клетки-хозяина. Если мишень не метилирована, ее узнавание приводит к реакции разрезания.

Источником метильных групп для модификации служит кофактор S-аденозилметионин (SАМ), который в ходе реакции превращается в S-аденозилгомоцистеин (SАН).

Механизм действия этих ферментов рестрикции-модификации сводится к их активации посредством связывания SAM с М-субъединицами. На начальной стадии реакции SAM действует как аллостерический эффектор, т.е. изменяет конформацию белка, обеспечивая его связывание с ДНК. Это конформационное изменение затрагивает S-субъединицу, ответственную как за узнавание сайта посадки в молекуле ДНК, так и непосредственно за процесс связывания. После взаимодействия фермента с ДНК, следует реакция с АТР.

Если фермент связался с полностью метилированным сайтом, в присутствии АТР происходит его отделение от ДНК.

В неметилированном сайте АТР индуцирует такую конформационную перестройку R-субъединиц, которая способствует разрезанию ДНК. Для процесса рестрикции необходим гидролиз АТР, при этом до акта разрезания ДНК от фермента отделяется кофактор SAM.

Роль АТР в случае частично метилированного сайта недостаточно ясна: в частично модифицированном сайте происходит метилирование с превращением SAM в SAH. Этот процесс идет и без АТР, но в его присутствии реакция идет более эффективно. Схема описанных выше трех процессов приведена на рис. 5.20.


Рис. 5.20

Ферменты типа  в присутствии SAM связываются с сайтами-мишенями, после чего они либо освобождаются из полностью метилированных сайтов, либо завершают модифицирование частично метилированных сайтов, либо двигаясь вдоль цепи ДНК от неметилированных сайтов, производят разрезание ДНК в каком-то удаленном участке (Lewin B., Genes III, New York, Wiley, 1987).


Для сайтов узнавания и разрезания ферментов I типа характерны необычные взаимоотношения. Сайт разрезания может быть удален от сайта узнавания на расстоянии от 400 до 7.000 пар нуклеотидов (среднее расстояние составляет около 1.000 пар оснований). Разрезание производится не в специфической последовательности, но и не в случайном сайте: имеются области предпочтительные для событий рестрикции. Реакция разрезания протекает в две стадии. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом другая. В областях, прилегающих с каждой стороны к сайту разрезания, может происходить экзонуклеотическая деградация ДНК. При этом происходит эффективный гидролиз АТР, роль которого пока не выяснена.

Каким же образом фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно удаленный? Важно отметить, что белок никогда не отделяется от молекулы ДНК, с которой он первоначально связался. Следовательно, узнавая сайт связывания, белок не отделяется от неметилированной ДНК для того чтобы найти сайт разрезания. Существуют две альтернативные модели, объясняющие взаимосвязь между сайтами узнавания и разрезания: в соответствии с одной из них фермент движется по молекуле ДНК, согласно другой модели, перемещается ДНК. Предполагаемые схемы этих процессов представлены на рис. 5.21.



Рис. 5.21

Схема, показывающая возможные варианты взаимосвязи между сайтами узнавания и разрезания для ферментов типа . Одна модель предполагает перемещение рестриктазы вдоль ДНК от сайта узнавания к сайту рестрикции (А). В соответствии с другой моделью фермент остается связанным с сайтом узнавания, а ДНК протаскивается через центр рестрикции фермента (В) (Lewin B., Genes III, New York, Wiley, 1987).


Если движется фермент, то его перемещение вдоль ДНК будет продолжаться до тех пор, пока он не сделает выбор сайта разрезания. Если же движется ДНК, то фермент остается прикрепленным в сайте узнавания, а ДНК протаскивается через второй активный центр на ферменте, и это продолжается до тех пор, пока область разрезания (еще не охарактеризованная) не попадет в этот центр. Полученные в самое последнее время электронно-микроскопические данные свидетельствуют, что фермент вызывает образование петли в ДНК и остается, по-видимому, связанным с сайтом узнавания, а это, в свою очередь, подтверждает вторую модель взаимосвязи сайтов узнавания и разрезания.

Наиболее детально изученными ферментами рестрикции и модификации типа III являются Eco P1 и Eco P15, кодируемые плазмидами Р1 и Р15 у Escherichia coli и Hin f, обнаруженный у Haemophilus influenzae серотипа Rf.

Каждый фермент состоит из субъединиц двух типов, а именно: R-субъединицы, ответственной за рестрикцию (молекулярная масса 106.000 – 110.000 дальтон) и субъединицы MS, ответственной как за узнавание, так и за модификацию (молекулярная масса 73.000 – 80.000 дальтон). У ферментов типа III рестрикционная и модифицирующая активности выражаются одновременно.

Сначала фермент присоединяется к своему сайту на ДНК (данное взаимодействие представляет собой АТР-зависимый процесс). Затем активности модификации и рестрикции начинают конкурировать друг с другом за вступление в реакцию с ДНК. Метилирование ДНК происходит в сайте посадки фермента, что согласуется с объединением двух функций – метилирования и узнавания в одной субъединице MS. Рестрикционное разрезание происходит на расстоянии 24-26 пар оснований от сайта узнавания. Рестрикция сводится к внесению ступенчатых разрезов с образованием «липких концов», имеющих уступы из 2-4 оснований.

Ферменты метилируют остатки аденина, однако сайты-мишени для Р1 и Р15 имеют загадочное свойство. Они могут быть метилированы только на одной цепи. Ниже приведены последовательности этих сайтов:



Р1

^ AGACC TCTGG

P15

СAGCAG

GTCGTC



Возникает закономерный вопрос, как сохраняется состояние метилирования после репликации. На рис. 5.22, приведенном ниже показано, что в процессе репликации формируется два типа сайтов.




Рис. 5.22

Репликация метилированной последовательности Р1 приводит к образованию метилированной и неметилированной реплик.


Одна реплика содержит исходную метилированную цепь и фактически не отличима от родительской. Другая реплика полностью неметилирована и поэтому представляет собой последовательность-мишень для рестрикции или модификации. Чем объяснить, что из этих двух возможностей чаще реализуется вторая? Ответ на данный вопрос в настоящее время неизвестен. Однако, одно из возможных объяснений состоит в том, что реакция метилирования непосредственно связана с актом репликации. Достаточно вспомнить функционирование системы исправления ошибок спаривания при репликации.
Молекулярная основа мутаций. Причины мутаций. Действие физических факторов
Одним из фундаментальных требований, предъявляемых к структуре, которая выполняет роль постоянного хранилища информации является ее чрезвычайная стабильность. Эта стабильность существенна, по крайней мере, в смысле тех характеристик структуры, которые обеспечивают кодирование генетической информации. Поэтому необходимым свойством структуры ДНК является высокая стабильность содержания в ней азотистых оснований и их последовательности. Однако, целостность оснований, их состав и последовательность в молекулах ДНК не полностью ограждены от постепенных изменений. Обычно такие изменения происходят не часто и затрагивают всего несколько оснований. Различные химические и физические факторы могут модифицировать структуру определенных оснований или даже разрушать фосфодиэфирные связи, приводя тем самым, к разрывам цепей. Ошибки также могут возникать в процессе репликации или рекомбинации, вызывая встраивание одного или нескольких дополнительных оснований в новую цепь. Вместе с тем, почти в любом случае необходимо осуществление нескольких циклов репликации для того, чтобы появившаяся модификация могла привести к необратимому изменению в ДНК. Другими словами, ДНК-полимераза должна использовать в качестве матрицы изначально поврежденную полинуклеотидную цепь для того, чтобы исходные изменения стали постоянными (см. рис. 5.1). Как показано на рис. 5.1, использование в качестве матрицы поврежденной цепи обеспечивает распространение повреждения от замены одного единственного основания в одной цепи до полного изменения пары оснований в обеих цепях, а последующая репликация навсегда сохранит это изменение. Необратимые изменения в структуре ДНК получили название мутаций.

Открытие генетической роли ДНК естественным образом породило представление о том, что мутации возникают в результате изменений в последовательности нуклеотидов.

Некоторые мутации возникают в результате нормальных, обычных процессов в клетке, или при взаимодействии нуклеинового материала с окружающей средой. Такие мутации называют самопроизвольными или спонтанными мутациями: они появляются с определенной частотой у любого организма.

Однако, частоту мутаций можно существенно увеличить, воздействуя определенными соединениями. Наследственные изменения, возникающие под действием таких соединений называют индуцированными мутациями, а сами соединения - мутагенами. Большинство мутагенов действует прямо, реагируя либо с определенными азотистыми основаниями, либо встраиваясь в нуклеиновую кислоту.

В процессе мутагенеза любая пара оснований может мутировать. Изменения, которые затрагивают только одну пару оснований, называют точечными мутациями. Точечные мутации могут быть двух типов. К первому типу точечных мутаций относят замены одного пурина на другой пурин, или одного пиримидина на другой пиримидин и называют такие мутации транзициями. Примером транзиции может служить замена пары C-G на T-A или наоборот. Это наиболее часто встречающийся тип точечных мутаций. Ко второму типу точечных мутаций относят трансверсии, которые характеризуются заменами пурина пиримидином и наоборот, т.е. пара A-T превращается в T-A или C-G.

Одной из возможных причин точечных мутаций, относящихся к транзициям является химическое превращение одного основания в другое. Примером может служить превращение цитозина (Сyt) в урацил (Ura) либо спонтанное, в ходе обычной реакции окислительного дезаминирования Сyt, либо под действием, например, азотистой кислоты (HNO2). Как показано на рис. 5.1, после дезаминирования Сyt, в последующем цикле репликации образовавшийся Ura спаривается с аденином (Ade) вместо гуанина (Gua), с которым спаривался бы исходный Сyt. Таким образом, пара C-G замещается парой A-T, что совершенно понятно, так как в последующем цикле репликации в пару с Ade становится тимин (Thy). В свою очередь, при действии азотистой кислоты может также происходить дезаминирование Ade, вызывая обратную транзицию A-T в G- C.




Рис. 5.1

Схема, иллюстрирующая последовательность событий приводящих к возникновению транзиции G-C  A-T.


Другой возможной причиной транзиций может быть ошибочное спаривание оснований, приводящее к образованию неканонических пар и, следовательно, к искажению двойной спирали ДНК. При обычной репликации такая ошибка может случайно произойти вследствие включения неправильного основания, представляющего собой редкую таутомерную форму. В этом случае спонтанная частота ошибок определяется прежде всего степенью точности функционирования ДНК-полимеразы. Существует также «репаративный» синтез ДНК, который активируется в результате генетической рекомбинации или возникших повреждений ДНК. Различные системы репарации также характеризуются разной частотой ошибок и, таким образом, могут даже увеличивать частоту наследуемых изменений в последовательности ДНК.
^ Некоторые соединения, которые можно отнести к мутагенам представляют собой аналоги обычных природных оснований, но эти аналоги способны к неканоническому спариванию. В процессе репликации они могут включаться в ДНК. Из-за ошибочного спаривания при их включении или при последующей репликации они могут вызвать целую серию транзиций. Примером такого мутагена может служить 5-бромурацил (5-Br-Ura). Это соединение включается в ДНК вместо тимина, но из-за того, что 5-Br-Ura достаточно эффективно спаривается также с гуанином (вместо аденина), его присутствие ведет к образованию замен пар А-Т на G-C. В каждом цикле репликации эти замены возникают с определенной вероятностью, поэтому 5-Br-Ura, однажды включенный в ДНК вместо тимина, продолжает индуцировать транзиции в последующих циклах репликации.
^ К следующему классу мутагенов относятся акридиновые соединения. Их связывание с ДНК настолько деформирует двойную спираль, что это приводит к вставкам (инсерциям) дополнительных оснований или к выпадениям (делециям) оснований при репликации. В результате каждого мутагенного акта, индуцированного акридином, исчезают или добавляются одна или несколько пар оснований. Мутации такого типа называют мутациями со сдвигом рамки считывания.

Долгое время считали, что основным типом мутаций в индивидуальных генах являются точечные мутации. Однако, в настоящее время известно, что, по крайней мере, у бактерий очень часто происходят вставки (инсерции) дополнительного материала или выпадение (делеции) части или целой вставки, а иногда и соседних с вставками участков ДНК. Источником этих вставок служат подвижные генетические элементы – определенные последовательности ДНК, которые способны перемещаться из одного места хромосомы в другое. Следует иметь в виду, что вставки и делеции могут возникать (хотя и с меньшей вероятностью) и по другим причинам – например, в результате ошибок во время репликации или рекомбинации.


^

Молекулярная основа мутаций



До сих пор мы рассматривали мутации как отдельные изменения в последовательности ДНК, влияющие на активность той генетической единицы, в которой они возникают. Если рассматривать мутации как способ инактивации генов, то у большинства генов и спонтанная, и индуцированная частота мутирования примерно одинаковы. Точнее, частота мутирования есть функция размера гена, т.е. мишени для мутаций. Но если рассматривать мутационные сайты (под сайтом в данном случае понимают одну пару оснований) внутри определенной последовательности ДНК, следует задать вопрос: все ли пары оснований в одинаковой степени чувствительны к изменениям или некоторые из них мутируют с большей частотой, чем другие?


^

Мутации концентрируются в горячих точках



Многочисленные генетические и биохимические исследования показали, что возникающие мутации локализуются вовсе не равномерно по всему геному. В некоторых сайтах происходит гораздо больше мутаций, чем следует ожидать при их случайном распределении. Их количество в определенных сайтах может быть в 10 и даже 100 раз больше случайного статистического возникновения. Такие сайты называют горячими точками.

Долгое время природа горячих точек была не ясна. Считали, что горячие точки должны соответствовать каким-то последовательностям, особенно чувствительным к спонтанным и индуцированным мутациям. Действительно, было обнаружено, что сайты одних типов оказывались горячими точками для спонтанных мутаций и мутаций, индуцированных одними мутагенами, тогда как другие мутации возникают в результате действия других мутагенов.

Главной причиной спонтанных точечных мутаций у E. coli является присутствие необычных модифицированных оснований, которые получили название минорных компонентов ДНК. Свое название модифицированных они получили вследствие того, что эти основания образуются посредством химической или ферментативной модификации одного из четырех обычных оснований, присутствующих в норме в ДНК. Однако в модифицированной форме, под действием ферментов репликации или репарации они в ДНК не включаются. Среди таких модифицированных оснований, которые появляются в ДНК уже после репликации наиболее известны 5-метилцитозин (5-Me-Cyt), 7-метилгуанин (7-Me-Gua) и 6-N-метиладенин (N6-Me-Ade). Наиболее распространенное модифицированное основание в составе ДНК – это 5-метилцитозин (рис. 5.2), который находят у про- и эукариот, и о котором уже упоминалось при описании структуры Z-формы ДНК. Модификацию осуществляет фермент метилаза, который добавляет метильную группу к цитозину только в определенных участках ДНК, модифицируя лишь незначительную часть всех остатков цитозина.




Рис. 5.2

Модификация остатков цитозина в составе молекул ДНК под действием метилазы.


В одном наиболее детально исследованном гене (ген lac I, который входит в состав lac-оперона, см. главу «Контроль генной экспрессии у прокариот») все горячие точки спонтанных, а также индуцированных точечных мутаций попадают в сайты, которые у дикого типа содержат 5-метилцитозин. Во всех случаях мутации возникали в результате транзиции G-C в А-Т. Более того, в штаммах E. coli с нарушенными процессами метилирования горячие точки обнаружены не были.

Причина таких замен заключается в том, что при спонтанном или индуцированном дезаминировании 5-Me-Cyt образуется Thy (рис. 5.3), а это, в свою очередь, приводит к ошибочному спариванию G с Т, что при последующей репликации может вызывать появление транзиции G-C  A-T.




Рис. 5.3

Дезаминирование 5-метилцитозина приводит к появлению тимина, который не в состоянии образовать каноническую пару с G, что может вызвать транзицию G-C  A-T.


В данном контексте уместно привести существующее предположение относительно того, почему в ДНК используется азотистое основание Thy вместо Ura, который, как известно, является обычным основанием для молекул РНК. Если в результате окислительного дезаминирования Cyt в ДНК появляется Ura, он воспринимается как ненормальное для дезоксирибонуклеиновой кислоты основание и поэтому удаляется под действием репарирующего фермента урацил-ДНК-гликозилазы (см. далее). В результате в соответствующем сайте остается неспаренный остаток гуанина, и система репарации по правилам комплементарности включает в поврежденный участок ДНК утраченный цитозин. Если бы в ДНК присутствовал в качестве обычного нормального основания Ura, то в случае дезаминирования Cyt ферментные системы не могли бы распознать какой из остатков Ura является правильным, а какой появился в результате дезаминирования Cyt. При окислительном дезаминировании 5-метилцитозина образуется тимин, который является обычным компонентом ДНК. Поэтому в таких случаях система репарации не всегда оказывается способной узнавать ошибку, что приводит к появлению мутации.
Другой важной известной горячей точкой в гене lac I является последовательность CTGG, которая повторяется три раза подряд. Мутации возникают в результате делеции или вставки одной четырехбуквенной единицы. Такие мутации могут появляться в результате «проскальзывания» при репликации, если одна цепь не точно совпадает с другой. Например, первая четырехбуквенная единица одной цепи может спариться со второй четырехбуквенной единицей другой цепи. В этом случае может произойти добавление или потеря четырехбуквенных единиц.
Мутант CTGG CTGG

 делеция

Дикий тип CTGG CTGG CTGG

 вставка
1   2   3   4   5

Похожие:

Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconПрактическое занятие № Механизм репликации ДНК доказательство полуконсервативного...
Доказательство полуконсервативного способа репликации ДНК. Эксперимент Месельсона и Сталя. Репликативная вилка. Одно- и двунаправленная...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconВ состав молекулы ДНК входит два пурина и два пиримидина. В ДНК имеются...
Во вновь образовавшейся цепи возникают углеводно-фосфатные и водородные связи. Таким образом, в ходе самовоспроизведения ДНК из одной...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconГенетика бактерий
Мендель установил существование генов. 1869 Фишер выделил ДНК. Через 80 лет доказано что носителем генов является днк, 1953 Крик,...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconПатрушев Л. И. Экспрессия генов
Обсуждаются наиболее важные аспекты развития современной молекулярной генетики в исследованиях направленного мутагенеза и белковой...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconВведение в биологию Учебное пособие
Днк на фрагменты, клонирование генов и клонирование кднк, создание зондов для гибридизации, полимеразную цепную реакцию, секвенирование...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconДнк подобный полимер для наноэлектроники
Наука часто обращается к природе за вдохновением и идеями, чтобы узнать, как сделать те или иные вещи рационально и эффективно. Вот...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconРепликация ДНК. Полимеразная цепная реакция
Для реализации этого принципа нуклеотиды, как вы помните, должны образовывать между собой водородные связи. А это становится возможным...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconВопросы к экзамену «Векторные системы»
Ферменты рестрикции. Классификация, значение для генной инженерии. Характеристика днк-лигаз
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconМетодическое пособие к заданию №1 по теме занятия: «Комплексная лучевая...
...
Практическое занятие № Системы защиты ДНК у прокариот. Репарация повреждений ДНК iconФосфор ( P) – органоген (0,95%)
Топография распределения в организме: белки. Днк, рнк, атф, кости, зубы, мышцы, нервная ткань
Вы можете разместить ссылку на наш сайт:
Школьные материалы


При копировании материала укажите ссылку © 2020
контакты
userdocs.ru
Главная страница